幼年型粒单核细胞白血病患者5例临床及基因分析

目的 分析幼年型粒单核细胞白血病(JMML)临床特点及基因变异,指导临床工作.方法 对临床诊断JMML患儿,用二代测序方法检测JMML相关基因突变,收集临床资料.结果 5例患者中,3例检测到PTPN11基因突变,2例检测到KRAS基因突变,均为体细胞杂合错义突变.中位随访时间6月(2～26月),2例PTPN11突变及1...     

靶向Hsp90β的siRNA对Jurkat细胞生长的抑制作用

目的 探讨RNA干扰技术沉默热休克蛋白90β(heat shock protein 90 beta,Hsp90β)基因表达对Jurkat细胞生长的抑制作用.方法 根据Hsp90β基因全长cDNA序列Hsp90B1(NM_003299.1),设计并构建针对Hsp90β基因的siRNA真核表达载体,应用LipofectamineTM LTX 转染入Jurkat细胞后,Real-time PCR检测 Hsp90β mRNA水平的变化,筛选出沉默效果最好的Hsp90β siRNA干扰片段;Western印迹法检测Hsp90β蛋白表达水平;MTT法和流式细胞仪检测干扰前后对Jurkat细胞生长抑制作用.结果 成功构建Hsp90β基因特异性的真核表达载体pSOS-Hsp90βi,转染Jurkat细胞后发现pSOS-Hsp90βi2的沉默效果最明显,Jurkat细胞Hsp90β mRNA及蛋白表达均明显降低(P<0.05).Hsp90β基因表达沉默后,Jurkat细胞增殖明显受抑(P<0.01),实验组与对照组的细胞凋亡率分别为:(2.69±0.34)%、(3.63±0.38)%、(19.56±0.62)%, 细胞凋亡率比空白对照组及转染pSOS-Hsp90βi control组明显增加,差异具有显著意义(P<0.05).结论 靶向Hsp90β的siRNA下调Hsp90β表达对人白血病Jurkat细胞有明显的生长抑制作用.     

沉默结缔组织生长因子基因重组腺病毒的构建及功能验证

目的:构建沉默结缔组织生长因子(connective tissue growth factor, CTGF)基因的复制缺陷型重组腺病毒Ad-siCTGF,并进行功能验证.方法:选取已验证的能高效沉默CTGF基因的靶序列,克隆入载体pSES-HUS中;将质粒线性化处理后与腺病毒骨架质粒pAdEasy共同转染大肠埃希菌BJ5183,构建重组腺病毒载体Ad-siCTGF;腺病毒载体用Pac I酶切线性化处理后转染HEK293细胞,包装重组腺病毒;采用"乒乓交互感染法"提高病毒滴度.用此病毒感染4T1细胞,行实时荧光定量PCR(real-time fluorescence quantitative -PCR, RFQ-PCR)及Western 印迹法验证其沉默效果.结果:Pac I酶切电泳证实重组腺病毒载体Ad-siCTGF构建成功,扩增纯化后测定重组病毒Ad-siCTGF的滴度为2.6×10~(10) pfu/mL.感染此病毒后,4T1细胞中CTGF mRNA表达水平下调至36.27%,蛋白表达水平下调至31.56%.结论:成功构建能沉默CTGF基因的重组腺病毒,为进一步研究CTGF在肿瘤中的作用机制奠定了基础.