融合蛋白AnxB1-MLT的表达、纯化及其对肝癌细胞SMMC7721和HepG2增殖的抑制作用

目的 以膜联蛋白B1(AnxB1)为导向分子,与蜂毒素(MLT)基因融合,制备AnxB1-MLT融合蛋白,探讨其对磷脂酰丝氨酸脂质体的结合活性及对肝癌细胞SMMC7721和HepG2增殖的抑制作用。方法 利用重叠延伸PCR技术构建AnxB1和MLT的融合基因AnxB1-MLT,克隆至原核表达载体pGEX-5T,转化至宿主菌K802,用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导AnxB1-MLT融合蛋白表达,优化表达条件,用谷胱甘肽-S-转移酶(GST)亲和色谱纯化柱纯化融合蛋白。采用磷脂结合实验验证AnxB1-MLT融合蛋白的钙依赖性磷脂结合活性,采用CCK-8方法分别检测AnxB1-MLT融合蛋白对肝癌细胞系SMMC7721和HepG2细胞增殖的影响。结果 AnxB1-MLT融合蛋白在宿主菌K802中能够表达,在菌液生长至D₆₀₀为0.6时,加入诱导剂IPTG至终浓度0.2 mmol/L,低温(22～24℃)诱导表达4 h,可使蛋白表达量较高且在上清有表达。通过GST亲和色谱纯化柱纯化融合蛋白,SDS-PAGE结果显示在63 000处可见单一目的条带,纯度>95%。AnxB1-MLT融合蛋白保留了AnxB1的钙依赖性磷脂结合活性,并能显著抑制肝癌细胞系SMMC7721和HepG2的增殖。结论 成功制备了AnxB1-MLT融合蛋白,该融合蛋白具有AnxB1的钙依赖性磷脂结合活性,可抑制肝癌细胞SMMC7721和HepG2的增殖,为进一步利用动物实验研究AnxB1-MLT的抗肿瘤效果奠定了基础。     

临床遗传学新增二级学科研究生培养体系的设置与探讨

随着营养性和传染性疾病的明显减少,人们对人类疾病中遗传因素的决定作用愈加重视,社会对临床遗传医疗服务有着迫切的需求。通过近年来临床遗传学学科在国内外发展状况分析,阐述了该学科设置的意义与研究价值,同时介绍了临床遗传学的学科内涵与主要研究内容,并探讨了临床遗传学学科研究生培养目标及学位与课程体系的设置。     

丙型肝炎病毒单链RNA免疫活性的研究

目的 筛选丙型肝炎病毒(HCV)单链RNA(single strand RNA, ssRNA)序列中有效的免疫激活序列,并进一步确定与免疫激活序列特异结合的蛋白。方法 筛选并合成4条HCV ssRNA序列中的寡聚核苷酸序列(HCV-ORNs),通过ELISA法检测其诱导的细胞因子表达情况,确定有效免疫激活序列。然后通过改良型凝胶阻滞实验及质谱分析技术筛选与该序列特异结合的蛋白。结果 在4个HCV-ORNs中,ORNHCVtail可有效诱导细胞因子TNF-α、IFN-α升高(P<0.01)。与ORNHCVtail特异结合的蛋白条带经质谱鉴定共鉴定出83种蛋白,其中可能与HCV ssRNA激活免疫反应相关的蛋白包括:TLR3(Toll-like receptor 3),NLRC3(NLR family, CARD domain-containing 3),NLRC4(NLR family, CARD domain-containing 4,又称IPAF)。结论 成功筛选出HCV ssRNA序列中有效的免疫激活序列,并筛选出与其特异结合的蛋白,为HCV激活天然免疫反应的机制研究奠定了基础。     

广泛肝切除联合肝固有动脉切除对正常大鼠及梗阻性黄疸大鼠的影响

目的 探索在正常及高胆红素血症情况下,大鼠70%肝切除联合肝固有动脉切除对肝功能、肝细胞能量代谢以及肝再生和细胞凋亡的影响.方法 雄性成年SD大鼠133只,将其中40只分为2组,每组20只,均行胆总管-十二指肠插管桥接,同时行70%肝切除或70%肝切除联合肝固有动脉切除.另87只行胆总管结扎制备梗阻性黄疸模型.5 d后手术分为70%联合肝切除胆肠再通内引流组,及70%肝切除联合肝固有动脉切除、胆肠再通内引流2组.动态观察术后24 h、72 h、7 d肝功能和肝细胞能量代谢、肝组织HGF和bcl-2 mRNA含量及其蛋白表达、肝细胞增殖指数和凋亡指数的变化,并统计各组死亡率.另取6只作为假手术组,测定术后0 h肝功能和肝细胞能量指标.结果 正常大鼠能够耐受70%肝切除联合肝动脉切除,术后肝细胞能量代谢和肝功能迅速恢复正常,肝再生良好.高胆红素血症时,大鼠术后肝再生受抑制,细胞凋亡增多.较之70%肝切除组,70%肝切除联合肝固有动脉切除组对肝细胞能量代谢的影响更为显著,术后肝功能恶化,肝组织HGF和Bcl-2 mRNA含量显著减少,肝再生明显受抑制,细胞凋亡增多,死亡率显著增高(P<0.05).结论 正常大鼠70%肝切除联合肝动脉切除术后肝再生不受影响,高胆红素血症时,70%肝切除联合肝动脉切除的大鼠死亡率高,因此术前引流减黄应是必要的措施.     

肝切除联合肝动脉切除对梗阻性黄疸大鼠肝细胞再生和凋亡的影响

目的 探索在梗阻性黄疸时,不同范围肝切除联合肝动脉切除对肝细胞再生和凋亡的影响.方法 155只雄性SD大鼠行胆总管结扎制备梗阻性黄疽模型,5 d后二次手术分为:胆肠再通内引流组;肝切除(42%、70%)联合胆肠再通内引流组;肝切除(42%,70%)联合肝固有动脉切除、胆肠再通内引流组.动态观察二次手术后24 h、72 h、7 d肝组织HGF、bcl-2 mRNA含量及蛋白表达、肝细胞增殖和凋亡指数的变化,并统计各组死亡率.结果 高胆红素血症、行胆肠冉通内引流的同时,大鼠肝切除或肝切除联合肝动脉切除后,肝再生均受抑制,凋亡增多;较之肝切除组和42%肝切除联合肝固有动脉切除组.70%肝切除联合肝固有动脉切除组术后肝组织HGF、bcl-2 mRNA含量显著减少,肝细胞再生明显受抑而凋亡显著增多,死亡率显著增高(P<0.05).结论 高胆红素血症时,肝切除量是影响大鼠肝切除联合肝动脉切除实施安全性的重要因素,42%肝切除联合肝固有动脉切除、胆肠再通内引流,对肝细胞再生和凋亡影响较小,安全町行;70%肝切除联合肝动脉切除、胆肠再通内引流后肝细胞再生显著受抑制,凋亡增多,死亡率高,应避免实施.     

Toll样受体7胞内区功能关键位点筛选及其机制研究

目的 筛选出TLR7 TIR区对其信号传递起关键作用的位点,并解释该位点的作用机制。方法 针对TLR7野生型序列,设计构建一系列TLR7缺失突变与点突变质粒。将这些质粒转染入HEK293T细胞,利用双荧光素酶报告基因检测这些质粒对NF-κB信号通路的影响。利用免疫共沉淀与蛋白质印迹实验验证TLR7突变体与其下游接头蛋白MyD88结合能力的变化。结果 通过对TLR7胞内区截短突变分析,发现在其TIR区存在一个由16个氨基酸残基组成的区域对其信号传递至关重要。进一步的研究发现,该区域存在一个RXR信号基序。该基序位于1004位与1006位的两个保守精氨酸残基,为TLR7正常信号传递所必需。通过免疫共沉淀与蛋白质印迹实验,可以发现TLR7位于1004位的精氨酸对其与下游蛋白MyD88的结合至关重要。结论 成功鉴定出TLR7 TIR区1004位的精氨酸对其信号传递起重要作用,该位点是通过影响TLR7与MyD88结合的方式发挥功能。     

运用现代教育技术,提高医学遗传学课堂教学质量

以加强硬件和软件建设为基础,搭建现代教育技术平台.将电化媒体技术(幻灯、投影、录音、电视、多媒体)、网络教学、PBL教学模式引入医学遗传学教学中,使教师-教材-学生有机融合为一体.授课内容以文字、图形、声音等形式呈现出来,加强与学生的互动,吸引学生注意力并增加学生的学习兴趣,以提高教学效果.     

临床遗传学实验教学体系的改革与实践

为培养具有基础思维能力与临床实践能力的遗传学创新型人才,根据遗传学的学科特点与学生实际情况,将遗传病分析与遗传实验教学相结合,从改进教学方法、开放实验室平台、构建多元化考核方法等方面,对临床遗传学教学体系进行了改革与实践,以提高教学效果.     

PBL 教学法在临床遗传学教学中的应用与思考

作为医科院校的遗传学教学工作者,如何教好临床遗传学,将遗传学原理和方法与临床实践相结合,是当前所面临的实际问题之一。 PBL教学法是一种以问题为基础的教学法,近年来在教育界受到广泛的关注。将PBL教学法引入临床遗传学的教学中,通过与传统教学法的教学效果进行对比,并探讨了PBL教学法的应用在充分发挥学生学习主体作用、促进基础理论与临床实践结合等方面的意义。     

核酸识别Toll样受体特性及在系统性红斑狼疮中的作用

系统性红斑狼疮（systemic lupus erythematosus,SLE）是一种由于免疫系统紊乱导致机体产生多种自身抗体的自身免疫病。SLE发病缓慢,临床表现多样化,涉及多个系统和多种脏器损伤,造成细胞和体液免疫功能障碍,产生多种自身抗体。SLE的常见临床表现为发热、皮疹、关节痛、浆膜炎及肾、心血管、肺、神经系统、消化系统等系统损伤,死亡率高。虽然目前SLE发病的确切机制尚不清楚,但对于其发病原因比较公认的是核酸识别Toll样受体对于自身核酸复合物的识别而引发的针对自身的免疫反应。