埃及伊蚊黄蛋白c基因的克隆、表达及其体外抗凝血作用

目的 克隆表达埃及伊蚊黄蛋白c (Aael-yellow-c)基因，并探讨r Aael-yellow-c蛋白体外抗凝血作用。方法 RT-PCR扩增Aael-yellow-c成熟肽基因，纯化后的片段与pEASY-E1载体连接，转化至大肠埃希菌DH5α感受态细胞，取菌液进行PCR、双酶切和测序鉴定。0.1 mol/L异丙基-β-D-硫代半乳糖苷诱导蛋白表达后，镍柱亲和层析纯化重组蛋白，采用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）和蛋白质免疫印迹（Western blotting）分析重组蛋白表达情况。比浊法观察不同浓度r Aael-yellow-c蛋白对二磷酸腺苷诱导的血小板聚集活性影响。手工法检测不同浓度r Aael-yellow-c蛋白对人血浆凝血酶原时间（PT）、部分凝血活酶时间（APTT）及凝血酶时间（TT）的影响。采用SPSS 18.0统计软件进行统计学分析，组间差异比较采用t检验。结果Aael-yellow-c基因CDS区为1 287 bp，含27个氨基酸组成的信号肽，成熟肽序列长1 200 bp，编码399个氨基酸。RT-PCR扩增获得Aael-yellow-c...     

检测DENV-2活病毒含量RTCA标准曲线法的建立

目的利用实时无标记细胞分析系统(real-time cellular analysis,RTCA)建立半数细胞指数时间(CIT50)与病毒滴度(TCID50)相关性的标准曲线,评估RTCA技术在监测2型登革病毒(DENV-2)感染BHK细胞后引发细胞病变效应(CPE)中的可行性和应用价值。方法检测不同培养条件下BHK细胞的CI值变化,筛选合适的初始细胞接种密度及血清浓度;应用RTCA分析已知不同TCID50滴度DENV-2感染BHK细胞的CIT50值,构建CIT50-TCID50标准曲线,计算回归方程;收集DENV-2感染C6/36细胞后第1~4d的培养上清(D1,D2,D3,D4),利用RTCA法和TCID50法分别检测上清中DENV-2滴度,分析CIT50-TCID50标准曲线法的灵敏度和可行性。结果 BHK细胞以初始接种密度为2×104个/孔,血清浓度为2%的培养条件为最佳;不同滴度DENV-2感染后BHK细胞的生长曲线均左移,CIT50与TCID50间呈线性负相关,线性方程为y=-7.007x+75.546(R2=0.9854);不同时间感染C6/36细胞培养上清中病毒含量(logTCID50/mL):RTCA标准曲线法为4.90±0.05(D2)、6.18±0.20(D3)、6.04±0.10(D4);传统TCID50法为0(D1)、6.25±0.49(D3)、5.87±0.35(D4)。结论利用RTCA技术建立的CIT50-TCID50标准曲线法,可用于已知DENV-2在BHK细胞的定量检测,结果较TCID50法更客观,且该法操作便捷且灵敏度高,为评估DENV-2感染性活病毒颗粒的毒力提供了新的技术手段。     

口服复方磺胺甲基异恶唑特殊反应1例报告

复方磺胺甲基异恶唑（Compound Sulfamethoxazole,SMZTMP,SMZco）可能引起的常见神经系统小良反应多为头晕、头痛,少数患者出现急性播散性脑脊髓炎。我院收治疗1例可能因口服复方磺胺甲基异恶唑引起的坐骨神经痛病例,现报告如下。     

白纹伊蚊3日龄成蚊饱血前后唾液腺总蛋白谱

目的探讨3日龄白纹伊蚊雌蚊吸食糖水组和饱血组唾液腺总蛋白谱的差异。方法分别采用Pierce蛋白定量试剂盒和SDS-PAGE电泳分析白纹伊蚊3日龄吸食糖水组和饱血组成蚊唾液腺蛋白质浓度和蛋白谱。结果糖水组蚊虫单对唾液腺蛋白质质量约为（1．243Э0．460）μg,饱血组约为（0．945±0．460）μg;SDS—PAGE检测到糖水组唾液腺总蛋白有12条主带,糖水组与饱血组唾液腺总蛋白条带没有变化。结论白纹伊蚊雌蚊饱血后唾液腺总蛋白无特异条带诱导,但饱血后单对唾液腺总蛋白下降。     

不同日龄白纹伊蚊雌蚊唾液腺总蛋白谱分析

目的:探讨不同日龄白纹伊蚊雌蚊唾液腺蛋白含量及总蛋白谱差异。方法:分别采用Pierce蛋白定量试剂盒和SDS-PAGE电泳方法,分析白纹伊蚊雌蚊各日龄唾液腺蛋白质定量及蛋白谱。结果:0日龄每对唾液腺蛋白质质量为(0.677±0.30)μg,3日龄为(1.454±0.46)μg,5日龄为(1.95±0.38)μg,7日龄为(1.733±0.46)μg,10日龄为(1.205±0.43)μg;SDS-PAGE检测到0日龄唾液腺总蛋白有12条主带,分别为15 kDa、18 kDa、30 kDa、32 kDa、34 kDa、40 kDa、45 kDa、48 kDa、50 kDa、62 kDa、68 kDa、>116 kDa 1条,还有其它比较弱的次带;3日龄以后的唾液腺总蛋白有12条带,但少了40 kDa条带,多了28 kDa条带。结论:不同日龄白纹伊蚊雌蚊唾液腺蛋白谱有一定差异。     

埃及伊蚊腺苷脱氨酶相关基因的鉴定和表达分析

为了筛选和鉴定埃及伊蚊全基因组中腺苷脱氨酶相关基因,并分析其在蚊虫不同发育时期、雌蚊不同组织中的表达差异,本文运用模式昆虫黑腹果蝇Dm-ADA基因的ADA结构域序列在NCBI埃及伊蚊全基因组数据库中筛选并鉴定埃及伊蚊ADA相关基因,采用ExPASy在线相关工具包分析其理化性质和结构域,运用Signal P4.0预测信号肽,结合使用Gene Doc和Mega6.0软件包进行同源性比对和构建系统进化树构建。首先提取埃及伊蚊不同发育时期(卵、Ι~Ⅳ龄幼虫、蛹、未吸血雌蚊、雄蚊)、雌蚊不同组织(唾液腺、中肠、脂肪体和卵巢)RNA并逆转录为cDNA,利用荧光实时定量PCR(qRT-PCR)方法对埃及伊蚊不同发育时期和雌蚊不同组织表达谱进行相对定量分析。结果显示,从埃及伊蚊全基因组中获得3条具有完整开放阅读码框的ADA相关基因(Aa-ADAL、Aa-ADGF-A、Aa-ADGF-B);尽管不同物种ADA基因家族成员间相似性较低,但8个酶活性位点高度保守。Aa-ADAL在2龄幼虫期(7.88)、卵巢(8.05)高表达;Aa-ADGF-A在3龄幼虫期(7.25)高表达;Aa-ADGF-B在雌蚊唾液腺(10.07)显著高表达。经分析,2条属于ADA2/ADGF亚家族,1条属于ADAL亚家族。     

埃及伊蚊体内wAlbB株沃尔巴克氏体感染的时空分布

目的了解沃尔巴克氏体(Wolbachia)在WB株埃及伊蚊体内不同时间和空间的分布状况。方法采用实时荧光定量PCR测定埃及伊蚊体内不同发育时期、不同日龄和不同组织的Wolbachia密度。结果埃及伊蚊卵和成虫期Wolbachia密度均高于其幼虫和蛹期(P<0.01);不同日龄雌、雄成蚊体内Wolbachia密度均随日龄增大而上升(P<0.05);同一日龄雌、雄成蚊体内Wolbachia密度随着日龄增长雌蚊显著高于雄蚊(P<0.01);雌蚊卵巢中Wolbachia密度显著高于脂肪体和中肠,但是与唾液腺之间的差异不具统计学意义(P>0.05)。结论wAlbB株Wolbachia密度受埃及伊蚊发育状态和日龄的影响,随日龄升高密度显著升高。这为进一步揭示Wolbachia与宿主之间的互作关系提供了基础数据。     

白纹伊蚊自噬基因ATG8蛋白多克隆抗体的制备及应用

目的 通过原核表达系统制备白纹伊蚊(Aedes albopictus,Aa)ATG8,免疫BALB/c小鼠获得多克隆抗体,并验证抗体的实用性。方法 从白纹伊蚊Aa23细胞中提取cDNA,通过PCR扩增AaATG8基因片段,然后与载体pET30a连接,构建原核表达载体pET30a-AaATG8并转化至大肠埃希菌DH5α感受态细胞,挑取单克隆进行PCR鉴定,提取质粒进行测序鉴定。再将重组质粒转化到大肠埃希菌BL21感受态细胞,用异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达重组蛋白rAa-ATG8,纯化透析后免疫Balb/c小鼠,制备多克隆抗体,采用ELISA检测抗体效价,并以该抗体为一抗采用Western blot检测不同物种ATG8蛋白的表达。结果 成功构建原核表达载体PET30a-AaATG8并在大肠埃希菌中诱导表达目的蛋白。重组蛋白纯化后免疫BALB/c小鼠,ELISA检测其血清抗体效价为1∶640 000;Western blot显示rAa-ATG8多克隆抗体可用于检测埃及伊蚊、中华按蚊、骚扰阿蚊、三带喙库蚊、家蝇ATG8蛋白,反应条带位于18、16或14 ku处。结论 成功获得高效价的...     

贵阳市家蝇对拟除虫菊酯类杀虫剂的抗性现状与kdr(L1014F)等位基因频率分析

探讨贵阳市区家蝇对拟除虫菊酯类杀虫剂抗药性水平与kdr等位基因上的LI014F点突变频率相关性,为贵阳市科学合理使用卫生杀虫剂控制家蝇提供科学依据.本研究采用WHO推荐的微量点滴法进行抗性测定.结果显示贵阳市4城区家蝇对氯菊酯和高效氯氰菊酯的LD50分别为0.00620 ～ 0.013339μg/雌蝇、0.02298 ～0.03614 μg/雌蝇,抗性系数分别为3.35 ～7.56、7.38 ～11.62.采用特异性等位基因PCR法测定基因频率,结果显示4城区家蝇种群的L1014F点突变频率在29％ ～37％.相关性分析显示L1014F点突变等位基因频率与高效氯氰菊酯LD50值之间存在直线相关.研究结果表明贵阳市家蝇对氯菊酯、高效氯氰菊酯已经产生了抗药性,击倒抗性是其抗性机理之一.     

贵州白纹伊蚊感染沃尔巴克氏体以及WO噬菌体的初步调查

目的了解贵州白纹伊蚊种群中沃尔巴克氏体(Wolbachia)以及WO噬菌体的感染情况。方法于2017年在贵州省贵阳市、都匀市、铜仁市、凯里市、遵义市、兴义市、贵安新区、毕节市采用勺舀法采集白纹伊蚊幼虫标本,实验室饲养至成蚊。提取雌蚊基因组DNA,PCR扩增沃尔巴克氏体表面蛋白基因(Wolbachia surface protein,wsp)和WO噬菌体衣壳蛋白的核糖体S7基因(Ribosomal S7 gene,orf7)。分别从8个地区的阳性检测标本中随机选取10个样品进行测序,使用DNAStar 7.0软件分析基因的基本特征;采用MEGA 4.0软件对所获基因序列进行分析比对,并构建系统进化树;采用SPSS 20.0软件对WO噬菌体侵染wAlbA、wAlbB株沃尔巴克氏体的检测结果进行关联性分析。结果贵州省8个地区的白纹伊蚊wAlbA和wAlbB株沃尔巴克氏体超感染率为84.30%(322/382),wAlbA株、wAlbB株沃尔巴克氏体单感染率分别为4.97%(19/382)和3.66%(14/382),WO噬菌体的感染率为76.44%(292/382)。通过测序获得沃尔巴克氏体的wsp序列,其中wAlbA株(379 bp)80条,wAlbB株(501 bp)78条;获得WO噬菌体的orf7序列(263 bp)73条。比对分析显示贵州省8个地区获得所有wAlbA株、wAlbB株的wsp序列、orf7序列的同源性均为100%。确切概率法分析WO噬菌体侵染与wAlbA和wAlbB株沃尔巴克氏体超感染有关联性(P<0.05)。结论贵州白纹伊蚊种群普遍感染WO噬菌体和沃尔巴克氏体,且以超感染wAlbA和wAlbB株沃尔巴克氏体为主。WO噬菌体主要侵染的对象是超感染wAlbA和wAlbB株的沃尔巴克氏体。