慢病毒载体表达外源PON1对小鼠巨噬细胞的影响

目的:为探讨对氧磷酯酶1(PON1)在机体代谢性疾病中的作用及机制,本实验构建含人源性PON1基因的慢病毒表达载体,研究其表达分泌PON1的能力及对小鼠巨噬细胞的影响。方法:根据人肝cDNA文库的PON1序列设计特定引物,定点诱变PCR获得两端为PmeⅠ内切酶位点的目的基因,经酶切连接到pWPI-GFP载体上,筛选及DNA测序鉴定。磷酸钙法瞬时转染293T细胞,荧光显微镜观察GFP表达反映转染效率,Western Blotting检测细胞培养基中PON1分泌表达量,采用对氧磷为底物检测PON1活性。含PON1的培养基与小鼠腹腔巨噬细胞共孵育,ELISA法检测氧化条件下细胞分泌肿瘤坏死因子α(TNF-α)、白细胞介素-6(IL-6)的水平。结果:构建的pWPI-PON1慢病毒表达载体序列正确,高效转染293T细胞(转染效率可达到80%-90%)可有效分泌表达PON1至培养基,显著提高培养基PON1活性,与对照组相比,培养基中PON1可明显抑制巨噬细胞炎症因子TNF-α、IL-6的分泌(P<0.01)。结论:pWPI-PON1慢病毒载体高效表达分泌的外源PON1能有效降低巨噬细胞的炎症反应。     

TaqMan-ARMS法快速检测人MTHFR基因多态性

目的利用PCR引物的错配扩增和荧光定量PCR技术,建立一种针对人亚甲基四氢叶酸还原酶(methylene tetrahydrofolate reductase,MTHFR)基因多态性的快速荧光扩增检测方法。方法收集已经测序验证的MTHFR基因C677T,A1 298C位点的野生型、杂合型和突变型样本,并据此构建野生型和突变型质粒;根据野生型MTHFR基因序列设计ARMS(扩增阻碍突变系统)引物和Taq Man探针并筛选出最合适的突变检测体系,与已知突变信息的214例样本进行比较,以验证该检测体系的可行性。结果建立的Taq Man-ARMS法性能评估优异,样本的最低检测限为10 copies/μL,样本间交叉检测无核酸扩增,体系检测阴性对照无核酸扩增;重复性及实验室内精密度结果良好,MTHFR-667位点和1 298位点重复性检测的标准差介于0.11~0.44,纯合和杂合样本的变异系数(CV)均4.52%。214例临床样本用该法检测结果与测序法的一致性为100%。结论基于Taq Man-ARMS法检测MTHFR的基因多态性方法简单,快捷,精确,适合用于临床样本快速诊断。