PAI-2ΔCD突变体的构建及其在大肠杆菌中的表达与纯化

目的构建ＰＡＩ－２ΔＣＤ突变体基因,实现在大肠杆菌中的表达并建立重组人ＰＡＩ－２ΔＣＤ的分离纯化方法。方法用ＰＣＲ扩增ＰＡＩ－２ΔＣＤ基因,经限制性内切酶片段分析及核苷酸序列分析后,突变体基因与原核表达载体ｐＬＹ－４重组并转化蛋白酶缺陷型菌株ＪＦ１１２５。经温度诱导表达,表达产物用ＳＤＳ－ＰＡＧＥ,Ｗｅｓｔｅｒｎ印迹法和纤溶抑制活性测定等方法鉴定。工程菌发酵后,经高压匀浆破菌,用离子交换、疏水性色谱和分子筛进行分离。结果经温度诱导表达,ＳＤＳ－ＰＡＧＥ证实在相应相对分子质量处出现表达条带,约占全菌总蛋白的１５％。Ｗｅｓｔｅｒｎ印迹法证实表达产物具有ＰＡＩ－２免疫原性,溶圈抑制法及翻转板法证实表达产物具有纤溶抑制活性。５Ｌ发酵菌液可得湿菌约１００ｇ,经多步纯化后,每升发酵菌液可得纯度达９７％的ＰＡＩ－２ΔＣＤ约３６ｍｇ,比活性为２８６４０ＡＩＵ／ｍｇ。结论成功构建了ＰＡＩ－２ΔＣＤ突变体,实现了在大肠杆菌中的表达,并成功地分离纯化了重组人ＰＡＩ－２ΔＣＤ蛋白。     

人纤溶酶原激活剂抑制物2型在胃癌组织中的分布与表达

探讨人纤溶酶原激活剂抑制物２型基因在胃癌组织中表达与分布的作用方法采用ＡＢＣ方法检测发生和未发生淋巴结转移的胃癌组织中ＰＡＩ－２、ｕ－ＰＡＴ的表达，各３０例。结论ＰＡＩ－２在胃癌组织中的表达与抑制肿瘤细胞的浸润与转移无明显相关。     

腰背痛与维生素D3受体基因多态性

[目的 ]目前认为维生素D3 的作用是由一种复杂的维生素D内分泌系统支持的。在腰背部的主要力学结构中 ,椎间盘、骨骼和韧带等都受到该体系的影响。而在单卵双生子中发现两者椎间盘退化的高度相似性 ,提示了遗传因素的影响。本研究为进一步探索维生素D3 受体 (VDR)基因多态性与腰背痛的发病关系。 [方法 ]用PCR SSCP技术对VDR基因的TaqI酶切位点上的多态性进行检测。在工人和教师两组血样中 ,工人组和教师组分别随机抽取 30和 2 0份全血标本。从全血样品中用试剂盒提取DNA ,然后对模版进行PCR扩增 ;扩增产物煮沸变性后骤冷 ,离心后上样进行电泳 ,电泳过程中保持 4℃温度 ,至胶的 2 /3处 ;然后将凝胶固定 ,进行银染 ,显色后进行拍照。 [结果 ]发现各样本的条带数目无变化 ,但在工人组中有两个样本显示两个条带的位置明显改变。提示有可能存在点突变。 [结论 ]遗传因素可通过影响骨骼肌肉的生理功能 ,从而影响腰背痛的发病和患病     

大肠杆菌表达的重组人PAI-2的纯化及其生物化学特性

目的研究建立大肠杆菌表达的重组人ＰＡＩ－２（ｒｈＰＡＩ－２）的纯化方法，并对ｒｈＰＡＩ－２蛋白进行理化和生物学性质的研究。方法工程菌被高压匀浆后，经硫酸铵分级沉淀，用分子筛、离子交换和疏水性色谱进行分离，得到了ｒｈＰＡＩ－２蛋白。对ｒｈＰＡＩ－２进行了复性，对ｒｈＰＡＩ－２的温度、ｐＨ、盐浓度、氧化剂敏感性、二级速率常数及抗ＳＤＳ复合物形成等理化性质和生物学特性进行了测定。结果每升菌液可获得约３０ｍｇ纯度达９０％的蛋白质，比活性为１１８６６ＡＩＵ／ｍｇ，得率为１９．２％。当温度高至６０℃时，ｒｈＰＡＩ－２迅速失活；当ｐＨ小于３时，ｒｈＰＡＩ－２完全失活；当盐浓度和Ｈ２Ｏ２浓度分别在１．５和０．５ｍｏｌ／Ｌ时，ｒｈＰＡＩ－２的活性仍维持在９０％以上；ｒｈＰＡＩ－２可与尿激酶形成抗ＳＤＳ复合物。结论成功地从大肠杆菌中分离纯化了ｒｈＰＡＩ－２。ｒｈＰＡＩ－２与天然ＰＡＩ－２在理化性质和生物学特性上基本一致。     

1706例中老年人群糖尿病患病率及其相关因素的调查分析

采用整体随机抽样的方法，对黑龙江省城市１７０６例中老年人进行了糖尿病患病率及其相关因素的调查。其患病率为５９．２％。调查表明，高血压病、高血脂症、超重、肥胖及糖尿病家族史等与糖尿病患病率有相关性。     

心律失常与Coxsackie B病毒感染

病毒感染是心律失常的病因之一。实验研究及动物试验证明Cox B 组病毒(CBV)可致心律失常。感染后抗体在体内持续时间较长,测定病毒抗体可追溯病毒感染的情况。我们测定心律失常和其它疾病患者及健康对照者246例的CBV IgG 抗体(CBV-IgG),现报告如下。对象和方法对象1.心律失常组86例,均无器质性心脏病。男58例,女28例;年龄1～63岁;病程1个月～7年,多数<1年。ECG 示。激动异常72例(房、室和交界性早搏,窦速、窦缓及窦不齐、阵发性心动过速或房颤),异常12例(A-VBⅠ～Ⅲ度,室内传导阻滞及预激综合     

对“酶试剂动态零值对测定结果的影响”一文的商榷

对“酶试剂动态零值对测定结果的影响”一文的商榷田昱，邹荣良，陆伟石（无锡市临床检验中心，江苏无锡２１４００２）［编者按］动态零值也称试剂速率（ＲＥＡＧＥＮＴＲＡＴＥ，ＲＧＴＲＡＴＥ）编者仅知国内只有ＴｅｃｈｎｉｃｏｎＲＡ系列自动生化分析仪的动态分析法...     

用双重PCR检测人巨细胞病毒DNA

选取HCMV IEV基因区为扩增的靶序列,合成两对引物,其中一对巢居于另一对之间。扩增片段分别为721 bP和167bp。单次PCR扩增灵敏度达0.5～1.0fg,双重扩增可提高灵敏度10～100倍。用HSV-1,HSV-2,CoxB组1～6型病毒培养物作模板,无非特异扩增。14例疑为CMV感染患儿尿标本经PCR测定,12例检出HCMV DNA,其中11例病毒分离阳性。PCR快速,可靠,比病毒分离简便易行,对临床HCMV感染的诊断有重要意义。     

人纤溶酶原激活剂抑制物-2型可抑制TNFα诱发的细胞凋亡

目的　研究纤溶酶原激活剂抑制物 2型 (PAI 2 )抑制细胞凋亡的分子机制。方法　用TNFα与放线菌酮协同诱发HeLa细胞建立HeLa细胞凋亡模型 ;将人PAI 2cDNA与真核表达载体 pcDNA3重组 ,构建PAI 2真核表达质粒并转染HeLa细胞 ,经G4 18筛选 ,NorthernBlot、WesternBlot鉴定筛选出稳定表达PAI 2的细胞株 ;运用结晶紫染色和MTT法检测表达PAI 2的HeLa细胞株对TNFα诱发细胞凋亡作用的抵抗作用 ,并检测胞外添加PAI 2对TNFα作用的影响和PAI 2对有H2 O2 引起的细胞损伤作用的影响。结果　HeLa细胞经TNFα诱导后发生凋亡 ;而PAI 2转染HeLa细胞后获得的三株表达克隆对TNFα诱导的细胞凋亡有明显的抵抗作用 ,对由H2 O2 引起的细胞凋亡无明显影响 ;胞外添加PAI 2对TNFα的作用无影响。结论　细胞内PAI 2的表达能抑制由TNFα引起的细胞凋亡 ,而对由H2 O2 引起的细胞凋亡无影响。