HLA-G14bp基因多态性与儿童Epstein-Barr病毒感染的相关性分析

目的 通过检测Epstein-Barr病毒(EBV)感染传染性单核细胞增多症(IM)患儿人类白细胞抗原G(HLA-G) 14 bp插入/缺失多态性及血浆可溶性HLA-G(sHLA-G)水平,探讨其与儿童EBV感染IM的相关性.方法 采用PCR结合聚丙烯酰胺凝胶电泳(PCR-PAGE)技术,对102例EBV感染IM患儿及165例正常对照儿童进行了HLA-G 14 bp插入/缺失多态性检测;采用ELISA检测了51例EBV感染IM患儿及146例正常对照儿童血浆sHLA-G水平.结果 EBV感染IM组与正常对照组HLA-G 14 bp插入/缺失基因型多态性分布频率差异有统计学意义(X2=6.742,P=0.034),两组等位基因分布频率差异亦有统计学意义(x2=6.672,P=0.01);EBV感染IM组血浆sHLA-G水平明显高于正常对照组,经检验差异有统计学意义(Z=-9.472,P＜0.01),EBV感染IM组不同基因型间血浆sHLA-G水平差异有统计学意义(H=6.09,P=0.048),14 bp+/+基因型组血浆sHLA-G水平明显低于另两组基因型(Z=-2.376,P=0.018).结论 HLA-G 14 bp插入/缺失基因型多态性与儿童EBV感染IM的发生有关,携带14 bp-/-基因型或缺失14 bp等位基因的儿童可能更易发生EBV感染.血浆sHLA-G水平可作为EBV感染IM的辅助诊断指标之一.     

重叠延伸PCR法构建β地中海贫血基因突变质粒标准品

目的:构建含β地中海贫血(简称β地贫)-28(A>G)与IVS-2-654(C>T)突变基因的质粒标准品。方法:以含β珠蛋白野生型基因的质粒DNA为模板,采用重叠延伸PCR(Overlap extension PCR,OE-PCR)定点诱变后行TA克隆的方法分别构建含-28(A>G)与IVS-2-654(C>T)突变基因的质粒。结果:DNA测序表明:重组质粒1的确含β地贫-28(A>G)突变基因,β珠蛋白-28处的碱基已由A突变成G,其余序列与野生型完全相同;重组质粒2的确含IVS-2-654(C>T)突变基因,β珠蛋白IVS-2-654处的碱基已由C突变成T,其余序列与野生型完全相。成功实现了定点诱变。结论:分别成功地构建了含β地贫-28(A>G)与IVS-2-654(C>T)突变基因的质粒标准品,进一步为HRM技术检测β地贫基因突变方法的建立及该病其它基因诊断与筛查技术的研究奠定了实验基础。     

传染性单核细胞增多症患儿血浆sHLA-G及外周血淋巴细胞亚群检测

目的 通过检测EB病毒(EBV)感染传染性单核细胞增多症(IM)患儿的血浆可溶性HLA-G (sHLA-G)水平及外周血淋巴细胞亚群比例,分析EBV感染IM患儿血浆sHLA-G水平与外周血淋巴细胞亚群的相关性.方法 采用酶联免疫吸附试验(ELISA),检测了51例EBV感染IM患儿及146例正常对照儿童血浆sHLA-G水平,采用流式细胞术检测了86例EBV感染IM患儿及30例正常对照儿童的外周血淋巴细胞亚群.结果 EBV感染IM组血浆sHLA-G水平130.30(77.28～217.23)U/ml,明显高于对照组的19.82(6.39～44.90) U/ml,经Mann-Whitney U检验差异有统计学意义(Z=-9.472,P＜0.01);EBV感染IM组外周血CD3+、CD8+淋巴细胞百分率较对照组明显上升、而CD4+、CD4 +/CD8+、CD16+56+、CD19+淋巴细胞百分率较对照组明显下降,差异均有统计学意义(均P＜0.01);EBV感染IM组血浆sHLA-G水平与CD3+、CD4+、CD8+、CD4 +/CD8+、CD16+56+以及CD19+细胞表达率间均无明显相关性.结论 EBV感染IM患儿血浆sHLA-G水平明显升高,并存在细胞免疫功能紊乱,血浆sHLA-G水平可作为EBV感染IM的辅助诊断指标,其升高的机制还有待于更深入的研究.     

HRM技术检测β-地中海贫血IVS-2-654(C＞T)与-28(A＞G)突变方法的建立及初步应用

目的 建立基于高分辨率熔解曲线(HRM)技术快速筛查β-地中海贫血(简称β-地贫)基因突变的方法,并初步探讨其临床应用价值.方法 选取温州地区人群β-地贫常见基因突变位点IVS-2-654(C＞T)与-28(A ＞G)作为研究位点,采用TA克隆技术构建其质粒DNA作为模板或基因分型对照,建立基于HRM技术检测β-地贫基因突变的方法,并对该方法的特异性、重复性、灵敏度等指标进行方法学评价.收集2009年11月至2010年10月温州医学院附属第二医院、育英儿童医院临床疑似β-地贫患者117例,抽取外周血标本,提取外周血白细胞DNA,用该方法进行IVS-2-654(C＞T)与-28(A ＞G)位点的HRM检测,并将检测结果与双向直接测序做比较.结果 建立的HRM技术可对β-地贫IVS-2-654(C＞T)与-28(A＞G)突变位点进行检测,未见非特异性扩增片段;不同基因型HRM检测的批内、批间熔解温度(Tm)值的变异系数(CV)均＜0.1％;该法最低可检出103拷贝的DNA模板,并可检测低至10％的突变存在.117份临床疑似β-地贫患者样本经该法检测,45份为IVS-2-654(C＞T)杂合突变型,9份为-28(A＞G)杂合突变型,未发现2个位点的纯合突变型基因;此结果与直接测序所得基因型结果完全一致.结论 建立的HRM技术操作简便,特异性强,灵敏度高,可用于β-地贫基因突变筛查,并为β-地贫其他突变位点的检测及基因组单核苷酸多态性分型等提供了一个通用的技术平台.     

浙江省温州地区住院患儿人巨细胞病毒感染状况分析

目的分析温州地区住院患儿人巨细胞病毒(HCMV)感染状况及血清标志物的分布特点。方法收集2010年3月至2011年2月期间5 215例温州地区住院患儿,按年龄将患儿分为<28d、28～d、6～月龄、1～岁、3～岁、7～14岁6个组,采用化学发光法(chemiluminescence immunoassay,CLIA)定量检测血清HCMV IgM/IgG抗体浓度,并对各年龄段HCMV IgM/IgG的阳性检出率及抗体水平进行分析。结果 5 215例住院患儿HCMV IgM阳性检出率为14.38%(750/5 215),HCMV IgG阳性检出率为82.45%(4 300/5 215),HCMV IgM和HCMV IgG同时为阳性12.98%(677/5 215);HCMV IgM阳性检出率以<28d组最低(1.06%,P<0.01),28～d组最高(21.48%,P<0.01);HCMV IgG阳性检出率以<28d和7～14岁两组高(分别为98.77%和86.54%,P均<0.01);HCMV IgM阳性浓度在6个组间分布差异无统计学意义(P=0.52),但随着年龄的增长有降低趋势(P=0.02);HCMV IgG阳性浓度以28～d组最低(P<0.05),且随着年龄的增长有升高趋势(P<0.01)。750例HCMV IgM阳性的患儿中,以呼吸道感染最多占34.80%(261/750),其中肺炎占16.93%(127/750)。结论温州地区住院患儿HCMV感染率高,以呼吸道感染为主,不同年龄组间患儿HCMV感染率及抗体浓度不同。     

血清uMtCK、PG、G-17 及CA72-4 联合检测 在胃癌辅助诊断中的价值

目的 探讨血清广泛型线粒体肌酸激酶（uMtCK）、胃蛋白酶原（PG）、胃泌素-17（G-17）、糖 类抗原72-4（CA72-4）联合检测在胃癌辅助诊断中的应用价值。方法 选取2018 年3 月—2019 年10 月在 青岛市中心医院住院治疗的90 例胃癌患者作为研究组,另选该院同期90 例胃部良性病变患者作为对照组。采 用酶联免疫吸附试验检测血清uMtCK 水平;采用化学发光法检测PG Ⅰ、PG Ⅱ及G-17 水平;采用电化学发 光法检测CA72-4 水平,探讨单独检测和联合检测的诊断价值。结果 研究组血清uMtCK、PG Ⅱ、G-17 及 CA72-4 水平高于对照组（P <0.05）,而PG Ⅰ、PG Ⅰ /PG Ⅱ（PGR）水平低于对照组（P <0.05）。研究组血 清uMtCK、PG Ⅰ、PG Ⅱ、PGR、G-17 及CA72-4 的阳性率高于对照组（P <0.05）,其联合检测的阳性率也 高于对照组（P <0.05）。研究组血清uMtCK、PG Ⅱ、G-17 及CA72-4 联合检测的敏感性为88.89%（95% CI ： 0.801,0.942）,准确性为86.11%（95% CI ：0.802,0.905）,均高于各单项指标检测（P <0.05）。AUC 结果显示 uMtCK、PG Ⅱ、G-17 和CA72-4 联合检测诊断价值最大（AUC=0.976）,PG Ⅰ诊断价值最小（AUC=0.810） （P <0.05）。结论 血清uMtCK、PG Ⅰ、PG Ⅱ、PGR、G-17 及CA72-4 联合检测对胃癌具有较好的诊断价值。     

转录因子GATA-1与人巨细胞病毒UL111A基因5'上游序列结合的实验研究

 目的：利用人巨细胞病毒（human cytomegalovirus，HCMV）潜伏及再激活感染THP-1细胞模型，研究细胞核内转录因子GATA-1与HCMV UL111A基因5'上游DNA序列的相互作用。方法：采用免疫印迹（Western blotting）技术定量分析HCMV潜伏及再激活感染时细胞核内转录因子GATA-1的表达；通过MATCH工具软件分析UL111A基因5'上游DNA序列，发现存在着11个GATA-1的结合位点，针对这11个GATA-1结合位点DNA序列设计9对引物，采用染色质免疫沉淀（chromatin immunoprecipitation, ChIP）及实时荧光定量PCR技术分析转录因子GATA-1与UL111A基因5'上游DNA序列的结合情况。结果：HCMV潜伏感染时UL111A基因未表达cmvIL-10，激活感染时表达cmvIL-10，潜伏感染时转录因子GATA-1的相对表达量高于激活感染；以GATA-1抗体特异性结合的DNA片段为模板，9对引物中共有5对扩增出目的条带；HCMV潜伏感染组和激活感染组5个位点转录因子GATA-1结合率分别为：-4.00±0.26、-4.50±0.33、-4.41±0.21、-3.61±0.20、-3.47±0.11和-1.13±0.07、-0.63±0.05、-1.10±0.07、-0.24±0.03和-0.14±0.01，差异均有统计学意义(P<0.05)。结论：HCMV感染时转录因子GATA-1可能通过与UL111A基因 5’上游序列1119（-3760）位点、107（-4772）位点、609（-4270）位点、849（-4030）位点和2047（-2832）位点结合，调节UL111A基因的转录，参与HCMV潜伏与再激活感染的过程。     

急性白血病患者血浆D-二聚体、血管性血友病因子、抗凝血酶Ⅲ、纤维蛋白原水平表达及意义

目的探讨急性白血病(AL)患者血浆D-二聚体(DD)、血管性血友病因子(vWF)、抗凝血酶Ⅲ(AT-Ⅲ)、纤维蛋白原(FIB)水平的表达及意义。方法选取该院2013年1月至2017年1月收治的79例AL患者,设为AL组,采取化疗方案予以诱导缓解治疗。并选取25例同期体检健康者为对照组。运用胶乳比浊法测定DD和vWF水平、发色底物法检测AT-Ⅲ水平、凝固法测定FIB水平,并计算原始及幼稚细胞比例(即瘤负荷)。结果与对照组比较,AL组治疗前血浆DD和vWF水平均明显上升(P0.05),AT-Ⅲ与FIB水平均明显降低(P0.05)。与AML组和ALL组同期相比,APL组治疗前血浆DD、vWF水平,均明显更高(P0.05);AT-Ⅲ、FIB水平,均明显更低(P0.05)。但AML组与ALL组以上血浆凝血指标对比差异均无统计学意义(P0.05)。与治疗前比较,AL组治疗后达完全缓解(CR)时血浆DD、vWF、AT-Ⅲ及FIB水平,均逐渐恢复正常,差异均有(P0.05);AL组治疗后达未缓解(NR)时以上凝血指标均无明显改变(P0.05)。经pearson相关性分析,治疗前AL组血浆DD、vWF水平与瘤负荷,均呈正相关(r=0.397、0.437,P0.05);但AT-Ⅲ、FIB水平与瘤负荷,均呈明显负相关(r=-0.364、-0.341,P0.05)。结论血浆DD、vWF、AT-Ⅲ、FIB水平能有效反映AL患者病情变化,可作为临床了解AL病情进展、指导用药及预后判断的辅助参考指标。     

重组hcmvIL-10的表达纯化及免疫抑制活性研究

目的:探讨重组人巨细胞病毒白细胞介素10(hcmvIL-10)对单核细胞的免疫抑制活性及分化相关基因表达的影响。方法:将重组的原核表达质粒pMal-c2X-hcmvIL-10和pMal-c2X-hIL-10转化受体菌E.coli BL21(DE3)进行诱导表达,采用Amylose-resin亲和层析纯化重组蛋白,并用葡聚糖凝胶(Sephadex G-75)进行二次纯化。纯化的重组蛋白hcmvIL-10和人白细胞介素10(hIL-10)分别与THP-1细胞作用后,采用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测培养细胞上清液TNF-α水平;实时荧光定量PCR与流式细胞术分别检测THP-1细胞HLA-DR mRNA及HLA-DR分子的表达;采用功能分类Th1-Th2-Th3 PCRARRAY检测分化相关基因表达谱。结果:重组蛋白hcmvIL-10和hIL-10经SDS-PAGE及Western blot鉴定与目的相符;不同浓度(2、10和50 ng/ml)重组hcmvIL-10和hIL-10分别与经PHA诱导的THP-1细胞作用48小时后,培养上清液中TNF-α的浓度分别为:(3.8±0.96)pg/ml、(1.95±0.51)pg/ml、(1.6±0.45)pg/ml和(2.49±0.43)pg/ml、(1.77±0.38)pg/ml、(0.98±0.16)pg/ml,除2 ng/ml重组hcmvIL-10处理组外,其它处理组与对照组比较均明显降低(P<0.01);不同浓度重组hcmvIL-10和hIL-10分别与THP-1细胞作用48小时后,HLA-DR mRNA相对表达量分别为:0.86±0.025、0.76±0.023、0.75±0.017和0.73±0.017、0.61±0.017、0.55±0.015,HLA-DR分子的表达分别为:(11.5±0.44)%、(10.1±0.30)%、(9.1±0.38)%和(10.9±0.10)%、(9.7±0.50)%、(7.5±0.32)%,除2 ng/ml重组hcmvIL-10处理组外,其它处理组与对照组比较均明显降低(P<0.01);功能分类Th1-Th2-Th3 PCR ARRAY共检测84个分化相关基因,hcmvIL-10处理组共有8个基因差异表达,上调基因为IL-12RB2、NFATC2、SOCS2、TYK2、GFI1和CEBPB,下调基因为CD80和CTLA4;hIL-10处理组共有5个基因差异表达,上调基因为SOCS2,下调基因为CD80、CD28、CTLA4和IL-6。结论:重组蛋白hcmvIL-10可抑制THP-1细胞分泌TNF-α,下调THP-1细胞HLA-DR分子的表达,类似hIL-10的免疫抑制功能;重组蛋白hcmvIL-10可影响THP-1细胞相关基因的表达,其差异表达基因与hIL-10不同。     

IgG抗体亲和力指数在儿童巨细胞病毒感染诊断中的意义

目的探讨IgG抗体亲和力指数(AI)在儿童巨细胞病毒(HCMV)感染诊断中的意义。方法分别收集120例临床疑似HCMV感染患儿的尿液和外周血标本,采用实时荧光定量聚合酶链反应(FQ-PCR)和微粒子酶免化学发光法检测尿液HCMV DNA载量和血清HCMV IgM/IgG抗体;采用尿素变性结合酶联免疫吸附试验(ELISA)测定HCMV IgG抗体亲和力指数(AI)。结果 120例疑似HCMV感染患儿的尿液HCMV DNA、血清HCMV IgM和HCMV IgG阳性检出率分别为70.83%(85/120)、60.83%(73/120)和76.67%(92/120),差异有统计学意义(χ2=7.252,P=0.027);25例HCMV IgM-/IgG+患儿中,以高亲和力抗体检出为主,占92%(23/25);67例HCMV IgM+/IgG+患儿中,以低、中等亲和力抗体为主,分别占26.87%(18/67)和53.73%(36/67);高、中、低IgG抗体AI患儿尿液HCMV DNA阳性检出率分别为36.11%(13/36)、86.84%(33/38)和100%(18/18),差异有统计学意义(χ2=32.262,P<0.01)。结论 IgG抗体亲和力指数测定能准确地反映HCMV感染的活动状况,有助于HCMV感染的诊断与治疗。