慢病毒载体法制备荧光素酶转基因小鼠

目的基于慢病毒介导的转基因方法制备荧光素酶(Luc)转基因小鼠。方法制备携带Luc基因的慢病毒,将其注入小鼠单细胞受精卵卵周隙以感染受精卵,然后将胚胎移植进假孕母鼠体内以获得仔鼠,应用小动物活体成像仪及PCR等在蛋白和DNA水平上筛选和鉴定Luc转基因小鼠。结果移植慢病毒隙感染后的成活胚胎63枚。将其移植至3只假孕母鼠,其中2只怀孕,共生仔鼠11只;利用小动物活体成像仪检测Luc表达,在蛋白水平证实11只F0代中,3只(命名为S1、S2、S3)表达Luc;DNA水平检测证实,3只Luc阳性小鼠的基因组中整合有外源转基因Luc。此外,Luc转基因首建鼠基因组中整合的Luc转基因可稳定遗传至下一代,并能正常表达。Luc转基因小鼠主要脏器如睾丸、肾脏、胃、肠、肺、脑、胸腺、肝脏和心脏等均可见Luc信号,但不同脏器间Luc强度有差异。结论成功制备Luc报告基因转基因小鼠。     

慢病毒载体法制备荧光素酶转基因小鼠

目的基于慢病毒介导的转基因方法制备荧光素酶（Luc）转基因小鼠。方法制备携带Luc基因的慢病毒,将其注入小鼠单细胞受精卵卵周隙以感染受精卵,然后将胚胎移植进假孕母鼠体内以获得仔鼠,应用小动物活体成像仪及PCR等在蛋白和DNA水平上筛选和鉴定Luc转基因小鼠。结果移植慢病毒隙感染后的成活胚胎63枚。将其移植至3只假孕母鼠,其中2只怀孕,共生仔鼠11只;利用小动物活体成像仪检测Luc表达,在蛋白水平证实11只F0代中,3只（命名为S1、S2、S3）表达Luc;DNA水平检测证实,3只Luc阳性小鼠的基因组中整合有外源转基因Luc。此外,Luc转基因首建鼠基因组中整合的Luc转基因可稳定遗传至下一代,并能正常表达。Luc转基因小鼠主要脏器如睾丸、肾脏、胃、肠、肺、脑、胸腺、肝脏和心脏等均可见Luc信号,但不同脏器间Luc强度有差异。结论成功制备Luc报告基因转基因小鼠。     

稳定过表达miR-26a肝癌细胞株的建立

目的建立稳定过表达miR-26a的肝癌细胞株。方法以CTE049质粒为模板,PCR扩增miR．26a序列418bp,片段两侧添加XbaI和BamHI酶切位点,In．Fusion克隆至pHAGE．fullEFla．MCS．IZsGreen中,次日挑选单菌落,提取质粒并进行测序和酶切鉴定;所构建的载体命名为pLVT．miR26a。获得pLVT．miR26a后,按Invitrogen公司推荐的标准程序进行慢病毒包装和确认慢病毒是否成功生产;携带miR．26a和ZsGreen基因的慢病毒感染小鼠肝癌细胞（Hepl．6）、人肝癌细胞（BEL．7402、HepG2、Sk—Hep．1、HepG2．1uc）,以建立稳定过表达miR．26a的肝癌细胞系：qRT．PCR检测所建立肝癌细胞系中miR26a的表达水平。结果测序和酶切证实成功构建了pLVT．miR26a,按标准程序生产的携带miR．26a和ZsGreen基因的慢病毒上清成功感染小鼠及人肝癌细胞。结论成功建立稳定过表达miR．26a的肝癌细胞株,为相关后续研究打下了良好基础。