人组织因子在毕赤酵母中的表达和纯化

 目的 制备具有凝血活性的重组人组织因子（recombinant tissue factor, r-TF） 用于构建 PT 试剂盒。 方法 将人组织因子胞外区编码基因与酵母表达载体重组，构建酵母表达质粒 pPIC9K-TF，利用电穿孔法转化宿主菌 Pichia pastoris GS115，转化子经 G418 抗性筛选后，获得高表达克隆。工程菌在摇瓶中经甲醇诱导，表达 r-TF，表达产物经纯化后，鉴定生物活性。 结果 SDS-PAGE 证实表达产物的分子量为 37000-45000,Western-Blot证明其为人组织因子衍生物，纯化后，r-TF 经脂化后，具有促凝血活性，为研制凝血活酶时间测定试剂盒及研究 TF 的构效关系创造条件。 结论 用毕赤酵母高效表达具有活性的rTF，表达量达到182mg/L。纯化工艺简便易行，蛋白回收率高，纯化后的rTF可用于组装PT测定试剂盒。     

血浆纤溶酶原活性发色底物测定法

纤溶酶原（ＰｌａｓｍｉｎｏｇｅＰｌｇ）是纤维蛋白溶解系统的重要组成成份，在多种生理和病理过程中起着重要作用。Ｐｌｇ测定对于肝脏疾病、血栓性疾病、感染性休克、ＤＩＣ、糖尿病、动脉粥样硬化等疾病的基础与临床研究及溶栓疗法的监控具有重要意义。目前国内尚未广泛开展此项检查，为此我们参考Ｆｒｉｂｅｒｇｅｄ［１］方法，加以改进，并采用本室合并的三肽发色底物Ｓ２３９０，和重组链激酶（ｒ－ＳＫ），建立了血浆纤溶酶原活性的发色底物测定法，其测定原理为：在过量链激酶（ＳＫ）作用下，血浆中Ｐｉｇ与ＳＫ按１：ｌ分子比形…     

可溶性组织因子的基因克隆、表达与性质研究

组织因子是外源性凝血途径的启动因子，为膜受体蛋白，胞外区的促凝血功能几乎与完整分子相同，因此采用重组DNA技术制备组织因子的胞外区分子，并对其活性进行研究，以便替代兔脑粉用于PT检测。以人胎盘总RNA为模板，用RT－PCR扩增组织因子胞外区cDNA基因，经序列分析证实后大肠杆菌中表达，产物形成包涵体。表达产物经复性，离子交换和凝胶过滤色谱纯化后与磷脂结合，进行促凝血试验。结果表明在磷脂存在下，可溶性TF有明显的促凝血活性，可以取代兔脑粉有于PT检测。     

锦鸡丙素对两株人肺癌细胞株蛋白激酶和同工酶活性的影响

目的　研究锦鸡丙素对两种人肺癌细胞株中不同组分的蛋白激酶C(PKC)活性及其同工酶分布的影响 ,探讨两种细胞株对锦鸡丙素的细胞生长抑制作用表现出敏感性差异的原因。方法　梯度离心法、32 P掺入法及蛋白印迹法。结果　①A5 4 9及HCI H4 46细胞所有组分中的PKC活性均可被锦鸡丙素所抑制 ,两种细胞胞质及颗粒组分中PKC活性完全受抑所需时间相同 ,A5 4 9细胞全细胞组分及核组分所需时间均长于NCI H4 46细胞 ;②A5 4 9细胞胞质组分中PKC的活性不可逆转 ,而HCI H4 46细胞为核组分 ;③ 5 4 9细胞中主要表达PKC α、ε和ζ ,胞质中三者都存在 ,颗粒组分中只检测到α且锦鸡丙素处理后α消失 ,而胞质及全细胞组分中的α含量增加 ;NCI H4 46细胞胞质中主要存在PKC ζ和ε,颗粒组分中仅检测到PKC ζ且锦鸡丙素处理后胞质中 ζ增加而颗粒组分中则减少。结论　锦鸡丙素体内外均可抑制PKC的活性并可降低PKC α在颗粒组分中的含量使其膜转位受阻 ,但这种抑制作用与肿瘤细胞生长的抑制之间并没有直接的联系 ;PKC α可能是A5 4 9细胞信号传导系统中最主要的PKC同工酶形式 ,锦鸡丙素抑制其活性并阻碍其膜转位将可能影响A5 4 9肺癌细胞的增殖并与A5 4 9细胞对锦鸡丙素敏感性较高有着密切的关系。     

重组人色素上皮衍生因子在真核细胞SP2/0中的瞬时表达及活性鉴定

目的 构建抑制早产儿视网膜病新生血管形成的重组人色素上皮衍生因子(pigment epithelium-derived factor,PEDF)真核表达载体,检测其在小鼠骨髓瘤细胞SP2/0中的瞬时表达.方法 根据已知的GenBank中人PEDF cDNA成熟蛋白编码区序列设计特异性引物,以全基因合成的pUC57-PEDF质粒为模板,经聚合酶链反应技术扩增人PEDF基因,定向克隆至真核表达载体pIRESneo3中,获得重组表达质粒pIRESneo3-PEDF.将重组质粒pIRESneo3-PEDF与脂质体转染试剂LipofectamineTM 2000混合后转染小鼠骨髓瘤细胞SP2/0,采用酶联免疫吸附试验及Western印迹对表达产物进行鉴定.收集转染细胞培养液上清,采用四甲基偶氮唑盐比色法检测重组PEDF活性.结果 聚合酶链反应技术、酶切鉴定和测序结果表明,pIRESneo3-PEDF表达载体构建成功.脂质体法将表达质粒成功转染到SP2/0中,经培养,可分泌表达PEDF,且经Western印迹检测证明为人PEDF,分子量为50 000.转染36 h上清液中PEDF浓度最高,为(0.92±0.04) μg/ml.转染36 h细胞培养液上清对人脐静脉内皮细胞的抑制作用最强(P<0.05).结论 成功构建人PEDF真核表达质粒pIRESneo3-PEDF,转染细胞可瞬时分泌表达有活性的人PEDF,对人脐静脉内皮细胞增殖有抑制作用,为开展下一步稳定转染表达及蛋白纯化奠定基础,为早产儿视网膜病的防治带来新的希望.

Abstract：

Objective To construct eukaryotic expression plasmid pIRESneo3-pigment epithelium-derived factor (PEDF) and detect its transient expression in SP2/0 cells. Methods Specific primers were designed based on the mature peptide sequence of human PEDF cDNA in the GenBank. Human PEDF gene was cloned into the eukaryotic expression vector pIRESneo3. The PEDF DNA was transfected into SP2/0 with LipofectamineTM 2000. The recombinant human PEDF protein expressed in SP2/0 cell culture supernatant was identified by Western blot and enzyme-linked immunosorbent assay. The biological activity of the recombinant human PEDF was measured by 3-(4,5-dimethylthiazol-z-y1)-2,5-diphenytetrazolium bromide(MTT) method. Results PCR amplification, restriction enzyme digestion and DNA sequencing confirmed that the mature peptide sequence of human PEDF cDNA was successfully cloned into the eukaryotic expression vector pIRESneo3. And the plasmid was transfected into SP2/0 cells, which could secret PEDF. Western blot analysis showed that there was only one obvious band at the position of relative molecular weight of 50 000, and it is equivalent to the expected value. Enzyme-linked immunosorbent assay suggested that the content of PEDF began to rise after transfection, and peaked at 36 h [(0.92±0.04) μg/ml]. The proliferation of human umbilical vein endothelial cell line was significantly inhibited by supernatant after transfection of 36 h (P<0.05). Conclusions The eukaryotic expression plasmid pIRESneo3-PEDF had been successfully constructed and active human PEDF was transiently secreted, which made a foundation for further study of stable expression and purification of PEDF. This protein could be a potential medication for preventing and managing retinopathy of prematurity.