热休克蛋白90α荧光免疫层析检测方法的建立

目的:建立人血清中热休克蛋白90α(HSP90α)的荧光免疫层析定量检测方法。方法:采用荧光免疫层析技术,对荧光微球制备、最佳反应时间、线性范围、精密性、回收率、临床检测等方面进行系统研究。结果:确定了各反应条件,最佳反应时间为5 min。线性范围0.39 ~100 ng/ ml。精密性质控品高值(30 ng/ ml)CV=8.14%;低值(10 ng/ ml)CV=9.26%,高、中、低值血清的回收率为100.56%、99.76%、94.1%;与国外试剂盒(ELISA 检测方法)平行检测40 份临床血清,结果显示两者相关系数为0.968 5。结论:初步建立的方法具有良好的精密性和线性,临床符合率能满足临床检测技术要求,有望完善后报批用于临床。     

抗丙型肝炎病毒抗体胶体金免疫层析法的建立

目的研制一种检测丙型肝炎病毒(Hepatitis C Virus,HCV)血清抗体的胶体金双抗原夹心免疫层析检测法。方法将丙肝重组抗原与胶体金连接形成免疫金,质控线与检测线分别包被HCV单抗与丙肝重组抗原,在样品垫上滴加10μl血清和90μl PBS溶液展开。通过加入6种非丙型肝炎阳性血清测试试纸条的特异性;将试纸条用国家血清盘质控品进行灵敏度测试;放置3种温度环境下10周,每周进行2次抽检,进行稳定性测试。结果本检测方法特异性、灵敏度且稳定性均较好,并可在10~15 min内判读结果,与酶联免疫法检测相比,检验符合率能达到较高水平。结论该法能够快速检测人血清中抗HCV抗体。     

RGD肽修饰病毒样颗粒靶向递送阿霉素的初步研究

目的:探究以乙肝病毒样颗粒(HBc-RGD-VLPs)作为递送抗癌药物DOX载体,制备靶向纳米复合物针对乳腺癌4T1细胞的生物学影响。方法:用制备的乙肝假病毒颗粒包封DOX,形成靶向纳米复合物HBc-RGD-VLPs/DOX。通过透射电镜及粒度仪检测颗粒的均一度及形态,并将其应用到4T1细胞进行体外生物活性探究。结果:...     

肠道病毒71型VP1基因的表达纯化及初步应用

摘　要：目的 表达纯化肠道病毒71型（EV71）VP1蛋白,初步建立人血清中抗EV71 IgG间接ELISA检测方法。方法 通过化学法合成肠道病毒EV71型VP1全基因序列,构建重组质粒pET-43.1a(+)/VP1,转化大肠杆菌Bl21（DE）3 ,IPTG诱导表达,镍金属亲和层析纯化目的蛋白,产物经SDS-PAGE和Western blot鉴定。以目的蛋白作为包被抗原,初步建立间接ELISA 检测方法。结果 成功构建重组质粒pET-43.1a(+)/VP1,表达纯化出较高纯度的EV71 VP1融合蛋白,初步建立人血清中抗EV71 IgG间接ELISA 检测方法。检测77份6-10岁健康儿童、手足口病现症患儿血清中抗EV71 VP1 IgG抗体阳性率分别为51.22%、61.11%。结论 表达产物具有较好的免疫原性,可用于肠道病毒EV71抗体检测试剂盒的研制。     

pH值对胶体金标记单克隆抗体性能的影响

目的探讨pH值对胶体金标记单克隆抗体(mAb)性能的影响。方法用K2CO3调整胶体金溶液的pH值,得到pH值在5.0~9.0范围内的胶体金溶液,并用抗肠道病毒71型(EV71)VP1 mAb进行标记,牛血清白蛋白(BSA)封闭。用紫外-可见光谱扫描监测该标记过程中胶体金的性能改变。采用Mey氏稳定化实验检测免疫金的稳定性并检测制得的成品胶体金试纸条的灵敏度。结果 EV71-VP1 mAb在胶体金溶液pH值为7.0~8.5范围内制备的免疫金较稳定,且制得试纸条灵敏度高。结论 pH值是影响胶体金稳定性、决定胶体金与mAb间作用力的重要因素,并证实了紫外-可见光谱扫描评价pH值对胶体金标记的效果,建立了用紫外-可见光谱选择最适标记pH的方法标准。     

HPV16/18 E6蛋白荧光免疫层析联合检测方法的建立

目的建立宫颈上皮细胞中人乳头瘤病毒(HPV)16/18型E6蛋白的荧光免疫层析联合定量检测方法。方法采用荧光免疫层析原理和双抗体夹心法,制备荧光免疫层析联合检测试纸条,并对线性范围、精密性、特异性等性能指标进行评价。结果实现了对HPV16/18 E6蛋白的联合定量检测;HPV16 E6蛋白线性范围为2.0~200 ng/ml,HPV18 E6蛋白线性范围为2.0~200 ng/ml;与鳞状细胞癌抗原(SCCa)、人附睾蛋白4(HE4)无明显交叉反应;批内CV均小于10%,批间CV均小于15%,平均回收率分别为102.4%和98.1%;检测经临床病理确诊的宫颈癌样本46份、癌前病变CINⅢ样本38份及健康样本52份,本方法敏感性分别为91.3%、84.2%,特异性达到100%。结论初步建立了联合定量检测HPV16/18 E6蛋白的荧光免疫层析方法,为临床筛查宫颈癌提供一种新的检测手段。     

建立联合检测人附睾蛋白4、糖类抗原15-3 荧光层析方法

目的:建立联合检测HE4、CA15-3荧光免疫层析的方法。方法:采用双抗体夹心法与荧光免疫层析相结合,联合检测HE4、CA15-3,并对检测时间、线性范围、最低检出限、精密性等指标进行评价。结果:检测时间15 min,HE4和CA15-3线性范围分别为15.6～1 500 pmol/L和7.8～500 U/ml;最低检出限分别为14.33 pmol/L和5 U/ml;批内与批间精密性均小于15%;准确率均在90%以上;与罗氏电化学发光法平行检测60份临床样本,相关系数均在95%以上。结论:初步建立了定量联合检测血清中HE4、CA15-3的荧光免疫层析检测方法,有较好的临床应用前景。     

去甲肾上腺素完全抗原的制备、鉴定及小鼠体内免疫效果的观察

目的制备鉴定去甲肾上腺素完全抗原为制备高灵敏度和特异性抗去甲肾上腺素（NE）单克隆抗体提供条件。方法分别用戊二醛法（GA）和碳化二亚胺法（EDC）在pH4．5和pH9．0条件下将NE与载体蛋白（ BSA、OVA）耦联制备完全抗原,采用紫外全波长扫描、SDS-PAGE和FeCl3显色反应3种方法进行鉴定;完全抗原腹腔注射小鼠并监测血清抗体效价。结果3种方法鉴定结果表明NE完全抗原制备成功,与pH4．5相比,在pH9．0条件下随着耦联时间的延长,NE的耦联比增加显著。间接ELISA结果显示,“检测抗原”和“免疫抗血清”配组测定时,当包被的“检测抗原”测定同种耦联方法制备的“免疫抗原”免疫小鼠后获得的“免疫抗血清”时,血清抗体滴度观测值高于与“检测抗原”制备方法不同的免疫小鼠抗血清,如：A组（BSA-NE-GA）测定C组抗血清（OVA-NE-GA）时测定结果高于A组测定G组抗血清（ OVA-NE-EDC）。结论用制备的NE完全抗原免疫小鼠成功产生了抗NE抗体。     

荧光免疫层析定量检测髓过氧化物酶方法的建立

目的：通过荧光免疫层析技术初步建立MPO荧光免疫层析定量检测方法。方法：采用羧基荧光微球，利用EDC一步法偶联标记抗体，对过程中EDC量、标记蛋白量与标记时间、保护液进行研究，选出最佳条件，并对线性范围、灵敏度、精密性等进行性能评价。结果：确定偶联过程中EDC 160 μg，标记蛋白125 μg、标记1.5 h；线性范围3.125~600 ng/ml，最低检出限0.9 ng/ml；精密性质控品(高、中、低)批内、批间变异系数均小于10%；通过与国外试剂盒（ELISA法）检测比对45份临床血清，相关性良好，R2=0.979 5。结论：成功建立荧光免疫层析快速定量检测MPO的方法，为冠心病的辅助诊断提供一种技术手段。