B型钠尿肽基因的克隆和原核表达载体构建及纯化

目的: 克隆人B型钠尿肽(脑钠素,B-type natriuretic peptide,BNP)基因,纯化其表达蛋白并制备多克隆抗体。方法: 用PCR技术从正常成人心脏组织cDNA库中扩增出人BNP基因,将其克隆进pUCm-T中并测定核苷酸序列。构建大肠埃希菌分泌性表达载体pGXE4T-2/BNP,用异丙基β硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达,GSH-agarose亲和纯化表达蛋白,用纯化蛋白免疫BALB/c小鼠,制备多克隆抗体。结果: 经PCR扩增成功获得96bp的BNP基因,测序正确,在大肠埃希菌中融合表达后,该蛋白的表达量占菌体总蛋白的19%,用SDS-PAGE和Westernblot鉴定大肠埃希菌中的表达产物,显示其相对分子量29500。经亲和纯化后GST-BNP的纯度可以达到95%,500ml菌液中得到纯化蛋白9.6mg。多克隆抗体的效价为1:32000。结论: BNP基因的克隆、表达和纯化成功以及多抗的获得,为建立BNP检测方法奠定了基础。     

氨基末端B型钠尿肽基因的克隆和原核表达载体的构建及纯化

目的 克隆人氨基末端B型钠尿肽（NT-proBNP）基因,构建原核表达载体并纯化其表达蛋白.方法 用聚合酶链反应（PCR）从正常成人cDNA库中扩增出人NT-proBNP基因,将其克隆进pUCm-T中测定核苷酸序列.构建大肠杆菌分泌性表达载体pGEX-4T-3-NT-proBNP,IPTG诱导表达,GSH-agarose亲和纯化该表达蛋白.结果经PCR扩增成功获得228 bp的NT-proBNP基因,测序正确,在大肠埃希菌中融合表达后,该蛋白的表达量占菌体总蛋白的23%,用SDS-PAGE和Western blot鉴定大肠埃希菌中的表达产物,显示其相对分子质量为34 600.经亲和纯化后的GST-NT-proBNP的纯度可以达到95%,得率为1.7 mg/100 ml.结论 NT-proBNP基因的克隆、表达和纯化成功,为建立NT-proBNP检测方法奠定了基础.     

聚酰胺-胺型树枝状聚合物介导人凝血因子Ⅷ的体外高效稳定表达

目的 应用纳米材料聚酰胺-胺型(PAMAM)树枝状聚合物／逆病毒基础的质粒载体复合体，在表达水平、持续时间和细胞毒性三方面进行血友病A基因治疗的体外研究。方法 PAMAM树枝状聚合物与含B区缺失(760aa～1639aa)人FⅧ cDNA(FⅧBD cDNA)的以逆病毒为框架的重组表达质粒载体pLNC-FⅦBD形成复合体后，转染NIH3T3细胞系，于转染后第2，5，10，15，30d留取细胞培养上清，分别采用一期法和ELISA法检测其中人FⅧ的凝血活性(FⅧ：C)和抗原含量(FⅧ：Ag)，并应用RTPCR方法检测细胞中FⅧBD cDNA的转录，以细胞生长抑制率来表示PAMAM的细胞毒性。结果 PAMAM载体介导的人FⅧ的体外表达可持续30d，24h内每ml细胞上清中10^6细胞表达FⅧ：C平均为0．929U，FⅧ：Ag平均为0．188μg，期间FⅧ表达未见降低；PAMAM的细胞生长抑制率为5．32％。结论 PAMAM能够有效介导逆病毒基础的质粒载体pLNC-FⅧBD转染靶细胞，并维持高效稳定表达，且PAMAM的细胞毒性较低。     

凝血酶调节蛋白植物凝集素样片段的原核表达及抗体制备

目的：制备凝血酶调节蛋白(thrombomodulin，TM)抗体。方法：原核表达目的蛋白，将表达的融合蛋白纯化后免疫小鼠。以EVC304包板的cell—ELISA检测抗体滴度，用Western blot和免疫组化鉴定抗体特异性。结果：目的蛋白在大肠杆菌中大量表达形成包涵体，将表达蛋白纯化并复性后免疫小鼠，3次免疫后得抗体效价为1：4000，经加强免疫后抗体效价达到1：8000；特异性较好。结论：在天然TM提取纯化困难的情况下，通过原核表达目的蛋白制备抗体是可行的。     

氨基末端脑利钠肽的原核表达与纯化及稳定性研究

目的从构建了人氨基末端脑利钠肽（amino-terminal probrain natriuretic peptide，NT-proBNP）基因的表达菌中抽取目的蛋白，并对其进行纯化、鉴定及稳定性的初步研究。方法取表达菌株BL21-pGEX-4T-3-NT-proBNP，IPTG诱导表达，GSH-agarose亲和纯化目的蛋白，提纯产物进行SDS-PAGE电泳和Western blot鉴定，并采用自动免疫分析仪检测其免疫反应性和稳定性。结果GST-NT-proBNP融合蛋白表达水平高，可溶性好。SDS-PAGE、免疫测定分析显示其相对分子量为34600，具有较高的特异免疫反应性和稳定性。结论NT-proBNP能通过基因工程手段以GST融合蛋白的形式大量获取，在非变性条件下得到的GST-NT-proBNP有较好的免疫反应活性和稳定性。     

氨基末端B型钠尿肽基因的克隆和原核表达载体的构建及纯化

目的克隆人氨基末端B型钠尿肽(NT-proBNP)基因,构建原核表达载体并纯化其表达蛋白。方法用聚合酶链反应(PCR)从正常成人cDNA库中扩增出人NT-proBNP基因,将其克隆进pUCm-T中测定核苷酸序列。构建大肠杆菌分泌性表达载体pGEX-4T-3-NT-proBNP,IPTG诱导表达,GSH-agarose亲和纯化该表达蛋白。结果经PCR扩增成功获得228bp的NT-proBNP基因,测序正确,在大肠埃希菌中融合表达后,该蛋白的表达量占菌体总蛋白的23%,用SDS-PAGE和Westernblot鉴定大肠埃希菌中的表达产物,显示其相对分子质量为34600。经亲和纯化后的GST-NT-proBNP的纯度可以达到95%,得率为1.7mg/100ml。结论NT-proBNP基因的克隆、表达和纯化成功,为建立NT-proBNP检测方法奠定了基础。     

人凝血因子ⅧcDNA在小鼠体内的转染与表达

本研究观察逆转录病毒载体和聚酰胺-胺型(PAMAM)树枝状聚合物介导的人凝血因子Ⅷ(FⅧ)基因在小鼠体内的转染和表达，并与体外转染方法作比较。应用含B区缺失(760aa-1639aa)人FⅧcDNA(FⅧBD cDNA)的以逆转录病毒为框架的重组表达质粒载体pLNC-FⅧBD包装成为逆转录病毒LNC-FⅧBD，ex vivo转染小鼠骨髓基质细胞，同时将pLNC-FⅧ BD与PAMAM树枝状聚合物按照1：15混合以形成复合体PAMAM-pLNC-FⅧBD进行小鼠in vivo转染。分别于注射后第24，48小时，第1，2，3，4周取血，分离血浆，采用一期法测定人FⅧ活性(FⅧc)，ELISA法测定人FⅧ抗原(FⅧAg)，并采用Bethesda inhibitor assay测定人FⅧ抗体；同时取脏器肝、脾、肺、肾提取RNA，进行RT-PCR，观察各组织的转录，并用苏木素-伊红染色法观察各组织的形态学改变。结果表明，逆转录病毒转染人FⅧ基因的骨髓基质细胞输入体内后，可以在体内继续表达人FⅧ，并且能有效地分泌至血液中。宿主小鼠体内可检测到的人FⅧ表达持续3周以上，注射后第24小时表达最高水平，人FⅧAg平均为8．6ng/ml，此后人FⅧ抗体逐渐生成，人FⅧ Ag水平渐低，于注射后第4周不再能测出人FⅧ Ag。注射复合体PAMAM-pLNC-FⅧ BD在体内转染后，获得了短暂的人FⅧ生理水平的表达，在注射后第48小时表达水平最高，人FⅧc和FⅧ Ag的平均水平分别为0．62U／ml和115．5ng／ml；注射后第3周平均水平降至0．042U／ml。RT-PCR结果表明，各脏器表达人FⅧ的水平不一，脾脏和肺脏表达水平高，且时间长，注射后各个时间点的小鼠血浆均未见人FⅧ抗体产生。组织病理学检查未发现小鼠各器官组织有病理改变。结论：经逆转录病毒介导的人FⅧ经ex vivo转染于BALB/C小鼠体内，其表达人FⅧ水平较低且该小鼠免疫原性增强，容易产生抗体；C57BL/6J小鼠在注射复合体PAMAM-pLNC-hFⅧ BD(即体内转染)后可获得短暂的人FⅧ生理水平的表达，在注射后第48小时表达水平最高，至少可持续表达2周以上。     

冠心病TM1418位单核苷酸多态性研究

我们在少量正常标本的测序中发现在上海汉族人群中凝血酶调节蛋白 (thrombomodulin ,TM)基因 14 18位存在C T多态性 ,且基因型频率与文献报道的白种人和黑种人基因型分布存在差异[1 ] 。我们旨在通过较大样本的测定来证实这一发现 ,并探讨其与冠心病 (CHD)的关系。对象和方法1　研究对象正常对照组 12 8名 (男 6 8名 ,女 6 0名 ) ,平均年龄 6 4 .6岁 ,经病史、体检与实验室检查排除心脑血管疾病。CHD组4 8例 (男 32例 ,女 16例 ) ,平均年龄 6 4 .5岁 ,来自上海市第九人民医院心内科病房。2　方法2 .1　DNA抽提 :采用酚 氯仿法提取外周…