在Sf9昆虫细胞-杆状病毒系统中表达毒蕈碱型M_2及M_5受体重组突变体

目的为乙酰胆碱毒蕈碱(M)受体亚型特异性的变构调节剂及基因工程的研究提供实验平台。方法用PCR及搭桥PCR法对乙酰胆碱M2及M5受体作以下突变:①将N-糖基化位点Asp突变为Asn;②删除对蛋白酶敏感的M受体的第三个细胞内环;③在C端添加凝血酶识别位点(CMV)和6-His标记。将PCR扩增出重组嵌合蛋白基因亚克隆到杆状病毒转移载体,制备重组杆状病毒并感染昆虫细胞表达M2/M5受体蛋白。Western印迹及放射性配体受体结合实验验证受体的正确表达及功能。结果通过搭桥PCR,成功扩增出1018 bp的重组M2受体和1041 bp重组M5受体核酸序列;使用pUC/M13的扩增引物成功构建M2/M5重组转移载体。将重组载体质粒与线性化病毒DNA共转染昆虫细胞Sf9,制备重组杆状病毒并感染昆虫细胞,见细胞空泡样病变。Western印迹分析确定重组杆状病毒感染昆虫细胞M2/M5蛋白表达,放射性配体受体饱和实验结果表明,表达的重组受体蛋白与[3H]N-甲基-东莨菪碱具有特异性结合能力。结论 Sf9昆虫细胞能够表达M2及M5重组受体蛋白,M2及M5重组受体蛋白的病毒样颗粒可用于M受体的新药研究。     

抗胆碱类药物在帕金森病治疗中的研究进展

帕金森氏病(PD)是一类困扰人类健康的重大疾病,属中老年神经系统退行性病变疾病,患者脑内多巴胺能系统功能低下,胆碱能系统功能亢进,影响患者的运动功能。PD是一种慢性进展性疾病,尚无根治方法,中枢抗胆碱药是早于左旋多巴用于帕金森氏病一类药物,目前因其临床用药无M受体亚型选择性,毒性作用多见,致使临床该类药物的研究滞后。大量研究发现M4受体亚型为中脑黑质纹状体内主要分布的M受体亚型,对中脑纹状体多巴胺(DA)的合成和释放具有重要的调节作用,对DA参与的运动功能调控发挥着重要的作用,很有可能成为帕金森病治疗抗胆碱类药物研发的一个重要靶标。本课题组研究发现具有M4受体亚型选择性的中枢抗胆碱药物盐酸去甲基苯环壬酯在小鼠震颤模型、6-OHDA黑质纹状体定向损毁大鼠模型及MPTP特异损伤C57BL/6小鼠模型均表现出良好的缓解帕金森病运动功能障碍作用,与临床常用的中枢抗胆碱药盐酸苯海索比较,其选择性增加纹状体内DA递质释放作用更显著,抗帕金森病药效更好,无认知损伤、胃肠道反应轻等副作用更低的特点。提示该药效学差异与二药间受体亚型选择性差异有关,本研究为临床合理开发具有M4受体亚型选择性的新型抗胆碱药物提供重要的理论依据。     

毒蕈碱型M5受体亚型及生物学特性

M5是最后一个被克隆出的乙酰胆碱毒蕈碱型受体亚型,具有G蛋白偶联受体家族的基本结构特征, 其信号转导方式既可以与G蛋白偶联,激活多种效应酶 (腺苷酸环化酶、磷脂酶C、磷脂酶A2 )产生相应的生物学效应,又可作用于离子通道来调节细胞间的信号传递。M5生理作用主要与调节中枢NO的生成和DA的释放有关,可能为药物滥用成瘾、DA系统功能障碍性疾病、阿尔采末病、脑缺血等的药物治疗提供一个新靶标。     

麻黄碱和伪麻黄碱中枢作用的比较

目的　通过与麻黄碱作对比 ,研究伪麻黄碱的中枢可能作用。方法　采用行为药理学实验法观察麻黄碱及伪麻黄碱对小鼠活动、戊巴比妥钠催眠作用及戊四氮和士的宁惊厥作用的影响。结果　腹腔注射麻黄碱 2 0、4 0、80mg·kg- 1后 ,小鼠外观活动表现兴奋 ,但不能够显著增加小鼠自主活动数 ,而腹腔注射同剂量伪麻黄碱对小鼠的自主活动均表现为抑制作用 ,其抑制率分别为 75 9%、73 4 %和 86 5% ,麻黄碱及伪麻黄碱 80mg·kg- 1对戊巴比妥钠催眠作用则表现出拮抗作用 ,对戊四氮和士的宁惊厥作用均无影响。结论　伪麻黄碱与麻黄碱的中枢作用不完全相同     

氰化钠加重缺氧诱导的小鼠脑神经损伤及机制

目的 研究氰化钠(Na CN)急性染毒对密闭缺氧致小鼠脑神经损伤的作用及机制。方法 (1)将小鼠随机分为缺氧+Na CN[0(缺氧对照组),2.56,3.8和5.1 mg·kg^-1]组,ip给予不同浓度Na CN染毒后立即放入密闭缺氧罐,观察小鼠缺氧存活时间。(2)将小鼠分为正常对照组、Na CN 3.8 mg·kg^-1组、缺氧30和60 min组及Na CN(3.8 mg·kg^-1)+缺氧(30和60 min)组,按分组处理后,用动脉血气分析仪检测小鼠动脉血气指标酸碱度(p H)、氧饱和度(s O₂)、氧分压(p O₂)和二氧化碳分压(p CO₂);用激光散斑成像仪检测小鼠大脑皮质脑血流;分别称量脑组织干、湿重,计算脑组织含水率;试剂盒检测海马总超氧化物歧化酶(T-SOD)活性和丙二醛(MDA)含量;TUNEL染色检测小鼠海马细胞凋亡率;HE染色检测海马组织病理变化。结果 (1)与缺氧对照组比较,缺氧+Na CN各剂量组小鼠缺氧存活时间均显著延长(P&l...