金黄色葡萄球菌蛋白A Z结构域的原核表达及多克隆抗体的制备

目的:制备金黄色葡萄球菌蛋白A(Sp A)Z结构域的原核表达蛋白及其多克隆抗体,并对其进行特异性鉴定。方法:3段Sp A-Z结构域经柔性肽(GS)串联连接构成三串联体(Sp A-3Z),经原核密码子优化后全基因合成,克隆至p ET21a(+)载体,构建p ET21a(+)/Sp A-3Z重组质粒,测序鉴定;将重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3),经异丙基硫代-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)诱导表达重组蛋白,用Ni-NTA亲和层析法纯化并经SDS-PAGE及Western Blot法分析鉴定;纯化的Sp A-3Z重组蛋白免疫日本大耳白兔,并分别于免疫前和免疫后采集血清,用ELISA法检测其多克隆抗体的反应和效价,并用Western Blot法分析多克隆抗体结合天然Sp A的特异性。结果:成功构建了p ET21a(+)/Sp A-3Z重组质粒;该重组质粒在原核表达系统表达并获得纯化的Sp A-3Z重组蛋白,SDS-PAGE电泳显示该蛋白的分子质量约为21 k Da,与理论分子量大小相符;日本大耳白兔经该蛋白免疫后可产生特异性的多克隆血清Ig G抗体,效价可达1:40 000;Western Blot法检测结果显示,在分子质量约42 k Da(天然Sp A蛋白)处出现单一条带,提示兔多克隆血清抗体可识别天然Sp A。结论:Sp A-3Z原核蛋白有较好的免疫原性和抗原性,制备的Sp A-3Z兔多克隆血清抗体Ig G效价高、特异性好,可进一步用于Sp A-Z相关的生物学和免疫学等功能研究。     

沙眼衣原体主要外膜蛋白21-387的原核表达及其免疫原性

目的:探讨沙眼衣原体(Ct)E血清型主要外膜蛋白(MOMP21-387)的原核表达及其免疫原性。方法:利用PCR方法扩增Ct E血清型MOMP第21至第387氨基酸的基因序列,克隆至p ET21a(+)原核表达载体构建重组质粒p ET21a(+)/MOMP21-387,并进行原核表达和纯化,经SDS-PAGE和Western blot法分析鉴定后,通过BALB/c小鼠免疫检测MOMP21-387蛋白的免疫原性,即通过ELISA法检测小鼠血清Ig G和生殖道分泌物Ig A抗体反应,乳酸脱氢酶(LDH)法检测其脾细胞的特异性杀伤作用。结果:在原核表达系统成功表达了MOMP21-387融合蛋白,经SDS-PAGE及Western blot法鉴定在相对分子质量(Mr)约44 000处出现特异性条带;并经NiNTA亲和层析的方法获得了纯化的MOMP21-387融合蛋白,免疫BALB/c小鼠可诱导产生特异性血清Ig G抗体和生殖道分泌物Ig A抗体,至第6周达到高峰,MOMP21-387组的Ig G和Ig A抗体较PBS组差异均有统计学意义(P<0.05);LDH检测结果显示,MOMP21-387组小鼠脾细胞对靶细胞的杀伤率,在10:1、20:1和40:1和80:1时均明显高于PBS组,差异有统计学意义(P<0.05)。结论:Ct E型MOMP21-387融合蛋白具有良好的免疫原性,为基于MOMP21-387的Ct的ELISA法检测方法的开发和疫苗研究奠定了基础。