p53缺失和突变对人肺癌细胞系恶性表型影响的比较

目的 比较研究外源正义和反义p53对所转染细胞系恶性表型的影响。方法 构建正义和反义p53C—DNA真核细胞表达载体pEGFP—p53(RS)，pEGFP—p53(AS)，载体有绿荧光蛋白基因监测基因转染和表达。经酶切图证明p53正向或反向联结。Liipofectin介导转染801D细胞(801D细胞有p53缺失和突变，蛋白表达阳性)，G418筛选，建立单克隆细胞系。PCR检测外源p53和neo基因。荧光显微镜检查转染细胞绿荧光蛋白表达。免疫组化染色证明突变蛋白表达。比较了pEGFP—p53(AS)和pEGFP—p53(RS)集落形成试验，裸鼠移植试验。FCM分析细胞周期。结果 酶切图证明pEGFP—p53(RS)和pEGFP—p53(AS)的p53c—DNA(RS)分别正向和反向联结质粒pEGFP。Lipofectin介导转染细胞801D细胞，G418筛选，获耐受集落，建立单细胞克隆转染细胞系pEGFP—p53(RS)—801D，pEGFP—p53(AS)801D和pEGFP—801D。PCR检测外源p53和neo基因存在于细胞，细胞可见绿色荧光，证明外源基因存在并稳定表达。免疫组化检测pEGFP—p53(AS)—801D，突变蛋白呈阴性，母系为阳性，显示反义p53封闭突变蛋白表达。pEGFP—p53(RS)—801D和pEGFP—p53(AS)801D细胞集落形成率和裸鼠移植成瘤率均降低，pEGFP—p53(RS)-801D更低。FCM分析细胞周期延滞。结论 有p53缺失和突变的人肺癌细胞系801D体内外恶性增殖明显，在同一细胞背景下，p53缺失比p53突变对恶性增殖起更重要作用。外源野生型p53在肿瘤细胞中可重建抑癌功能，外源反义p53可封闭突变蛋白表达，阻止细胞停留于G1期。     

肺癌P53基因治疗的实验研究和预后判断基因标记

肺癌死亡率在发达国家居癌死亡的首位。我国1992年流行病学调查资料显示肺癌死亡呈上升趋势,死亡率在大城市占癌死亡第一位。流行病学预测表明,今后30年肺癌死亡将继续增长,成为中国居民的主要死因。尽管近年来肺癌诊断、治疗方法不断改进,但肺癌死亡率仍未明显改观,近30年来,肺癌病人5年存活率仅从5％上升到13％。2/3术后病人5年内相继死亡。因此寻找新的诊断和治疗方法已是迫在眉睫的任务。随着对肺癌分子病因的深入了解和分子生物学方法的发展,研究基因诊断和治疗已成为可能,     

肺癌患者血清基质金属蛋白酶-9、内皮抑素、血管内皮生长因子的变化及其临床意义

目的 测定肺癌患者血清基质金属蛋白酶-9(MMP-9)、内皮抑素(endostatin,ES)、血管内皮生长因子(VEGF)水平,探讨其在肺癌中的特异性及其与化疗的关系.方法 应用酶联免疫吸附法(ELISA)测定3种因子在144例肺癌患者血清中的表达.结果 肺癌患者血清MMP-9、ES、VEGF分别为(678.06±38.79)ng/ml、(124.90±3.33)ng/ml及(809.81±129.43)pg/ml,显著高于对照组的(90.07±13.55)ng/ml、(61.0±5.15)ng/ml及(368.68±5.82)pg/ml,以及肺良性病变者的(228.96±15.39)ng/ml、(91.43±4.44)ng/ml及(490.14±14.58)pg/ml(P＜0.001);肺癌患者血清MMP-9、ES及VEGF水平与肿瘤组织类型、有无远处转移、临床分期及原发肿瘤大小相关(P＜0.05);化疗后3种因子分别为(569.23±100.08)ng/ml、(141.36±14.51)ng/ml及(680.94±130.47)pg/ml,与化疗前的(726.28±94.11)ng/ml、(127.86±13.24)ng/ml及(1415.01±587.22)pg/ml相比有显著性差异(P＜0.001);肺癌患者血清MMP-9与ES水平呈正相关(r=0.260,P=0.012).结论 肺癌患者血清MMP-9、ES、VEGF水平明显升高,在肺癌的病理疾病过程中有特殊意义,可作为预测肺癌恶性度和治疗反应的良好指标.     

联合检测血清MMP-9、endostatin与VEGF水平对晚期NSCLC诊断和预后的意义

背景与目的MMP-9、endostatin和VEGF是与多种恶性肿瘤有关的重要的血管生长调控因子。本研究旨在分析非小细胞肺癌（NSCLC）患者MMP-9、endostatin、VEGF水平在临床及预后中的意义。方法应用酶联免疫吸附法（ELISA）检测92例晚期初治NSCLC患者血清MMP-9、endostatin及VEGF水平，良性对照组50例，健康对照组52例。结果①肺癌患者治疗前血清中MMP-9、endostatin及VEGF水平显著高于健康人（P〈0．001）及肺良性病患者（P〈0．001）。②以健康人检测值的x^-＋2s为临界值，MMP-9、endostatin及VEGF检测的敏感度分别为92．51％、88．32％和83．4％，特异度分别为79．1％、74．25％和75．63％。③肺癌患者血清MMP-9，endostatin水平以x^-＋s为临界值（565．61ng/ml，119．23ng/ml）分组，检测值高于临界组生存期较检测值低于临界值组为短，两组患者预后有显著差异（P〈0．05）。④部分患者化疗后检测三项指标，疗效达PR＋SD患者中，MMP-9水平下降组与上升组预后有显著差异（P〈0．05）。结论肺癌患者血清中MMP-9、endostatin及VEGF水平显著增高，具有较高的敏感性和较好的特异性，对于指导临床肺癌诊断、估计预后有着重要意义。     

抗人肺腺癌单抗5F-11噬菌体抗体库的构建及表达

目的　构建抗人肺癌单抗 5F 11的噬菌体显示文库。方法　利用RT PCR方法从 5F 11杂交瘤细胞扩增抗体轻重链可变区基因 ,用连接子连接成为ScFv基因后克隆至噬菌体载体pCANTAB5E。以肺腺癌细胞系A2 为抗原进行 4轮筛选 ,得到富集的次级噬菌体表达文库。结果　制备了库容为 8× 10 7pfu/ml的噬菌体展示文库。随机抽取未经筛选的克隆进行酶切 ,酶切图谱呈多样性 ,富集后的酶切图谱则显示特异构型的噬菌体得到富集。检测 30个噬菌体克隆上清 ,其中 2 3个与A2 细胞有较强反应。结论　本研究获得了抗人肺腺癌单抗 5F 11的单链抗体 ,为拓展抗体的应用创造了条件。     

代谢酶基因多态性与肺癌易感性关系的研究

目的　探讨代谢活化酶细胞色素P45 0 1A1(CYP1A1)、2D6(CYP2D6)、2E1(CYP2E1)和代谢解毒酶谷胱甘肽硫转移酶 (GSTM 1)基因多态性与肺癌易感性的关系及重度吸烟对肺癌易感性的影响。方法　采用PCR、PCR RFLP等技术检测 180例原发性肺癌患者及 2 2 4例肺部良性疾病患者和正常人 (对照组 )外周血代谢酶基因型。结果　CYP1A1突变等位基因 (m )、CYP2D6野生型等位基因 (w )、CYP2E1A基因型和GSTM 1功能缺失型 ( -)可使患肺癌的危险性增加到 1.5 0～ 1.5 8倍 (P <0 .0 5 )。携带GSTM 1( -)者若同时携带CYP1A1、2D6或 2E1中任意 1个易感基因型 ,可使患肺癌的危险性升高到 2 .2 4～ 2 .69倍 (P <0 .0 5 )。携带相同基因型者 ,重度吸烟比不吸烟者患肺癌的危险性显著升高。重度吸烟人群中携带 4种易感基因型者患肺癌的危险性显著增高 ,达 9.85倍 ( 95 %CI =2 .3 0～ 45 .71)。结论　代谢酶基因的易感等位基因携带者患肺癌的危险性上升 ,且与烟草致癌物暴露剂量呈正相关。     

抗人肺癌噬菌体展示可溶性ScFv的筛选与鉴定及其序列测定

目的制备抗人肺癌单链抗体（single chain Fv ferment antibody,ScFv）,并对抗体生物学特性进行初步研究。方法以人肺腺癌细胞系A：为抗原,对5F一11杂交瘤细胞噬菌体抗体库进行富集和筛选。以人肺腺癌细胞系A2和正常人淋巴细胞为抗原,进行酶联免疫吸附试验,从富集后的噬菌体抗体库中筛选出只与A2细胞结合的阳性克隆。筛选的噬菌体克隆转染大肠埃希菌HB2151,得到可溶性单链抗体分泌克隆。可溶性抗体分泌克隆测序。应用ELISA、竞争性ELISA、SDS．PAGE及蛋白质印迹法对其中的2A7．1克隆进行初步鉴定。结果以肺腺癌细胞A2为抗原进行了4轮富集。进一步筛选得到18个仅识别A：细胞而与人淋巴细胞无反应的融合抗体分泌克隆。转染大肠埃希菌HB2151后筛选到能与Az细胞特异结合的可溶性抗体分泌克隆2A7．1。竞争性ELISA结果显示,5F-11能强烈抑制2A7-1与A2细胞的结合。SDS-PAGE蛋白质印迹法显示得到大小约为30X10。的单链抗体。结论通过噬菌体抗体技术成功分离到了鼠单抗5F-11的可溶性ScFv分泌克隆,为进一步的抗体应用研究奠定了基础。     

肺癌患者血清MMP-9，Endostatin，VEGF水平及临床意义

目的测定肺癌患者血清中MMP-9，endostatin，VEGF水平，探讨其在肺癌中的特异性及与化疗的关系。方法应用酶联免疫吸附法（ELISA），测定三种因子在144例肺癌患者血清中的表达。结果肺癌患者血清MMP-9、endostatin、VEGF水平显著高于健康人及肺良性病患者（P〈0．001）；肺癌患者血清MMP-9、endostatin及VEGF水平与肿瘤组织类型、有无远处转移、临床分期及原发肿瘤大小相关（P〈0．05）；化疗后VEGF、endostatin水平变化与疗效相关，有显著性差异（P〈0．001）；肺癌患者血清MMP-9，endostatin水平呈正相关（r=0．260，P=0．012）。结论肺癌患者血清MMP-9，endostatin，VEGF水平明显升高．在肺癌的病理疾病过程中有特殊意义，可作为预测肺癌恶性行为和治疗反应的良好指标。     

ScFv-ADM对肺癌细胞系的体外生长抑制作用

目的 观察抗肺腺癌单链抗体(ScFv)2A7-l-阿霉素(ADM)结合物对人肺腺癌细胞体外生长的抑制作用。方法 从抗肺癌可溶性ScFv抗体分泌克隆2A7-l上清提取可溶性抗体，浓缩、亲和层析纯化。分光光度计测定浓度。戊二醛法连接2A7-l、ADM制备结合物。分光光度计测定结合物中所含2A7-l和ADM的浓度，计算结合比例。集落形成试验观察该结合物对肺癌细胞体外生长的抑制作用。结果 制备的2A7-l-ADM结合物中ADM和2A7-1的md子比为3：l。连接后的结合物仍可特异结合肺腺癌A2细胞。克隆形成试验的结果显示：该结合物对肺癌细胞的抑制作用是单纯使用ADM的4倍。结论 本研究的结果显示2A7-1-ADM免疫结合物对肺癌细胞的生长抑制作用明显强于单独使用ADM，具有潜在的临床应用价值。