汉黄芩素对LPS-ATP诱导的巨噬细胞氧化应激的抑制作用

目的:探究汉黄芩素对巨噬细胞炎症反应中氧化应激的抑制作用。方法:将巨噬细胞RAW264.7分为对照组(正常培养不予刺激),模型组(LPS和ATP联合刺激,LPS刺激4 h后加入ATP刺激30 min),汉黄芩素干预组(同样予以LPS和ATP联合刺激,LPS刺激的同时加入汉黄芩素)。检测试剂盒检测SOD、NO、MDA分泌水平,免疫荧光检测各组细胞Nrf2的核转位情况,RT-qPCR检测Nrf2和抗氧化酶mRNA转录水平。结果:与模型组相比,汉黄芩素可减少LPS-ATP联合刺激的巨噬细胞MDA、NO分泌水平,上调Nrf2 mRNA的表达并促进胞浆内Nrf2的核转位,上调胞内抗氧化酶HO-1、SOD、GPx、CAT及NQO-1 mRNA的转录,增加SOD的活性。结论:汉黄芩素对LPS-ATP诱导的巨噬细胞氧化应激具有抑制作用,可能是通过抑制氧化应激来下调ROS水平,起到减轻炎症反应的作用。     

截断疗法与常规疗法抑制流感病毒性肺炎小鼠肺组织炎症作用的比较?

目的比较"截断疗法"和"常规疗法"对流感病毒性肺炎小鼠肺组织炎症反应的作用,以研究"截断疗法"优于"常规疗法"的作用机制,及与病毒感染后机体发生的炎症级联反应间的关系。方法 Balb/c小鼠192只,分为正常组、模型组、常规疗法组和截断疗法组,以50μL 30 LD50流感病毒鼠肺适应株FM1病毒液滴鼻感染后1 h灌胃给药。正常组和模型组以蒸馏水灌胃;常规疗法组第1、2、3天以银翘散水煎剂灌胃,第4、5、6、7天以犀角地黄汤水煎剂灌胃;截断疗法组第1~7天以犀角地黄汤合银翘散水煎剂灌胃;每日给药2次,共给药7 d。以上处理的小鼠分别于第2、4、6、8天摘眼球放血处死并取材、检测。观察肺泡灌洗液(BALF)白细胞总数,酶联免疫吸附测定法(ELISA)检测小鼠肺组织匀浆上清中白细胞介素-1β(IL-1β)和白细胞介素-18(IL-18)水平,实时荧光定量PCR(Real-Time-PCR)检测小鼠肺组织中NLRP3 mRNA的表达。结果截断疗法组和常规疗法组BALF中白细胞总数、IL-1β和IL-18,及NLRP3 mRNA与模型组比较均有不同程度下降,但截断疗法组在第2天BALF中白细胞总数、IL-1β和IL-18水平与模型组比较有显著降低(P0.01),而常规疗法组尚未显示出明显的作用;第8天截断疗法组白细胞总数明显低于常规疗法组,有显著性差异(P0.01)。感染后第4天,模型组小鼠肺组织中高表达NLRP3 mRNA,截断疗法组NLRP3 mRNA表达明显减少,常规疗法组与模型组比差异不显著。结论截断疗法在感染早期即可抑制固有免疫应答所诱发的炎症反应,有效阻止了随后的炎症级联反应的发生,截断疾病的传变。其机制可能与抑制NLRP3炎性体的形成、干扰IL-1β和IL-18的成熟和分泌有关。     

一种猪-鼠B细胞杂交瘤的制备方法

目的：探索一种异源杂交瘤细胞株建立的方法．方法：以CSFV分点肌肉注射健康猪,成功诱导机体产生抗CSFV的抗体．取免疫猪脾脏与鼠骨髓瘤细胞NS0融合,经筛选与克隆以获得猪源抗CSFV的mAb,并测定mAb的中和性及其效价．结果：成功筛选到15株抗CSFV的猪源mAb,中和实验结果表明9株mAb具有中和性,且同样识别重组的E2蛋白．结论：猪源mAb的成功制备为揭示CSFV在猪体内的免疫机制奠定了基础．     

稳定敲低NLRP3 基因的小鼠巨噬细胞系的建立与鉴定

目的:建立NLRP3 炎性体缺损的小鼠巨噬细胞模型。方法:构建靶向NLRP3 基因的带GFP 和Neo 标记的shRNA 表达载体,转染小鼠巨噬细胞RAW264.7 后用G418 抗性标记筛选稳定转染的细胞克隆,并利用GFP 标记通过流式细胞仪进一步纯化,得到的细胞命名为RAWNKD。利用定量PCR 检测RAWNKD 细胞及其在LPS 和ATP 联合刺激下NLRP3 基因的稳定抑制效果。结果:RAWNKD 细胞GFP 标记的阳性率在80%以上,NLRP3 基因的抑制率超过90%,即使用LPS 和ATP联合刺激NLRP3 基因mRNA 增加也不明显。结论:成功建立了NLRP3 基因稳定敲低的小鼠巨噬细胞系,这种NLRP3 炎性体缺损的巨噬细胞是探究NLRP3 炎性体活化途径及其介导的炎症信号转导的有力工具。     

犀角地黄汤合银翘散通过PKC-SSeCKS通路抑制TNF-α诱导的肺微血管内皮细胞通透性增加

目的:观察犀角地黄汤合银翘散(XDY)对TNF-α诱导的大鼠肺微血管内皮细胞(PMVEC)通透性的影响及其与PKC-SSeCKS信号通路的关系,以探究该方治疗病毒性肺炎的作用环节和分子机制。方法:原代培养大鼠PMVEC,在Transwell小室上用电导法于不同时点监测TNF-α诱导的PMVEC跨内皮细胞单层电阻(TER)测定其通透性。不同的干预因素作用24 h后,检测PMVEC的TER、PKC活性、SSeCKS mRNA水平和磷酸化SSeCKS蛋白水平,激光共聚焦显微镜观察PMVEC中SSeCKS的定位和F-actin的结构变化。结果:TNF-α作用24 h后PMVEC通透性达高峰;与对照组比较,TNF-α组TER降低,PKC活性增强;与TNF-α组比较,TNF-α加PKC抑制剂组和TNF-α加XDY含药血清组PKC活性降低,而TER升高且与对照组无差别。与对照组比较,TNF-α组SSeCKS的mRNA和蛋白表达升高;与TNF-α组比较,TNF-α加XDY含药血清组SSeCKS的mRNA水平和磷酸化SSeCKS蛋白水平降低。对照组PMVEC中F-actin主要分布在细胞周边和核周,形成致密周围束,SSeCKS均匀散在分布于细胞中;TNF-α组细胞周边的F-actin致密束基本消失,SSeCKS集中分布于核周;TNF-α加含XDY含药血清组F-actin结构及SSeCKS的分布趋于正常。结论:犀角地黄汤合银翘散可以抑制TNF-α诱导的PMVEC PKC信号通路的激活,降低PKC结合底物SSeCKS的表达,最终影响肌动蛋白的变构、阻止内皮细胞变形而降低PMVEC的通透性。     

原核表达、稀释复性的人FcγR Ⅱ a恢复IgG的结合功能

目的 探讨原核表达稀释复性的可溶性人FcγR Ⅱ a(shuFcγRⅡa)的胞外区蛋白在体外与配体的结合活性.方法 应用PCR技术从重组质粒pc3huR Ⅱ中扩增huFcγR Ⅱ a的胞外区基因,将其克隆于原核表达载体pET-28a中.所构建的重组质粒经PCR和酶切鉴定后转化大肠杆菌B121(DE3),IPTG诱导表达,制备融合蛋白包涵体.并采用多次洗涤法分离和纯化包涵体,用稀释法对纯化后的目的 蛋白进行复性,ELISA和流式细胞术测定重组shuRⅡ在体外与配体的结合活性.结果 扩增到了huFcγRⅡa的胞外区基因,所构建的pETshuRⅡ重组质粒经PCR和酶切鉴定与设计序列一致.转化BL21(DE3)后,IPTG诱导目的 蛋白表达率约为30%.SDS-PAGE初步测定目的 蛋白的相对分子质量(Mr)约为24.8×103,与理论预期值一致.破菌后电泳证实目的 蛋白主要以包涵体形式表达,经多次洗涤后蛋白纯度大于90%.ELISA法测得重组shuRⅡ与人IgG在体外有良好的结合活性,流式细胞术测得重组shuRⅡ对配体与受体结合有抑制作用.结论 本复性方法可得到和天然蛋白类似生物学活性的目的 蛋白.     

人FcγRⅠ受体胞外区基因的克隆、原核表达及纯化

目的:探讨人FcγRⅠ(huFcγRⅠ)胞外区蛋白的原核表达纯化及其在体外与IgG的结合活性。方法:PCR方法从人的外周血白细胞中扩增出huFcγRⅠORF区全长基因并与T载体链接,从克隆载体huFcγRⅠ-T中扩增huFcγRⅠ胞外区基因,并将其装入原核表达载体pGEX-6p-1。构建好的载体转化大肠杆菌BL21(DE3),以IPTG诱导重组蛋白表达,并利用SDS-PAGE和Western blot对表达的蛋白进行鉴定。结果:扩增到了huFcγRⅠ的胞外区基因,所构建的pGEXhuFcγRⅠ重组质粒经PCR和酶切鉴定与预期一致。IPTG诱导下目的蛋白的表达率约为30%。SDS-PAGE结果显示表达的目的相对分子质量(Mr)56 700与理论预期值一致。West-ern blot结果显示原核表达的huFcγRⅠ胞外区蛋白与人IgG特异亲和。结论:FcγRⅠ(huFcγRⅠ)胞外区蛋白在原核表达系统中得到有效的表达,复性蛋白在体外与人的IgG特异结合。     

汉黄芩素对LPS 和ATP 联合诱导的巨噬细胞炎症反应的抑制作用

目的:探究汉黄芩素对巨噬细胞炎症反应的抑制作用。方法:设正常对照组,LPS和ATP联合刺激组(LPS刺激4 h后加ATP刺激30 min),汉黄芩素干预组(刺激的同时加入汉黄芩素)。利用免疫荧光法观察各组细胞NF-κB的核定位,荧光定量PCR法检测各组细胞IL-1β、IL-18、IL-6、TNF-α、NLRP3及Caspase-1的mRNA水平,流式细胞术检测各组细胞活性氧(ROS)水平,酶联免疫吸附法检测胞外IL-6和TNF-α水平。结果:与LPS和ATP刺激组相比,汉黄芩素干预组细胞胞内NF-κB核定位明显减少,胞内IL-1β、IL-18、IL-6、TNF-α、NLRP3和Caspase-1的mRNA,胞内ROS及胞外IL-6和TNF-α水平都显著降低(P0. 01)。结论:汉黄芩素可能通过减少巨噬细胞ROS的产生,降低NF-κB的核定位,进而弱化NF-κB调控的炎症相关分子的基因转录来干预巨噬细胞的炎症反应。