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目的 化学合成针对乙型肝炎病毒(HBV)S基因的siRNA,同时制备针对相同区段的shRNA表达框,并比较二者对HepG2.2.15细胞中HBV基因表达和病毒复制的抑制作用。方法 化学合成针对HBVS基因的带有FITC标记的siRNA,设计合成带有FTrc标记的引物,PCR扩增含有RNA聚合酶Ⅲ启动子H1序列和shRNA编码序列的表达框,并对扩增产物进行纯化,将等摩尔数siRNA和shRNA表达框分别用脂质体转染稳定表达HBV的HepG2.2.15细胞,转染1d后流式细胞仪检测转染效率,转染3d后RT-PCR检测靶基因mRNA的水平,用SDS-PAGE、Westem blot及间接免疫荧光染色检测HBsAg的表达。收集转染前和转染后1、3、5和7d的细胞培养上清,检测HBsAg水平,同时用荧光定量PCR方法检测HBV DNA的含量。结果成功制备了针对HBVS基因的shRNA表达框,将其与等摩尔数siRNA分别转染HepG2.2.15细胞后,RT-PCR证实细胞中HBV mRNA水平降低,SDS-PAGE、Westem blot及间接免疫荧光染色检测到HBsAg的表达受到抑制,细胞培养上清中HBsAg和HBV DNA含量下降。与siRNA相比,shRNA表达框对HBV的抑制作用虽然起效较慢,但持续时间更长。结论shRNA表达框和siRNA均可明显抑制HBV的转录和表达,与siRNA相比,shRNA表达框能够更持久地抑制靶基因的表达。 相似文献
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靶向X区的siRNA抑制乙型肝炎病毒基因的表达和复制 总被引:1,自引:0,他引:1
目的构建针对乙型肝炎病毒(HBV)X基因的siRNA表达载体,观察其对HBV基因表达和复制的影响。方法设计并合成针对HBVX区基因的siRNA寡核苷酸,经退火形成双链后克隆人pSUPER载体,构建成功的siRNA表达载体与pTK-Hyg质粒共转染稳定表达HBV的HepG22.2.15细胞,潮霉素抗性筛选获得稳定细胞克隆,对所得细胞培养上清液中的HBsAg和HBeAg进行定量检测,逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测靶基因mRNA的抑制效果,荧光定量PCR检测HBVDNA。结果成功构建了针对HBVX基因的siRNA表达载体pSUPER-X1和pSUPER-X2,两种siRNA均能明显抑制HepG22.2.15细胞的HBsAg和HBeAg分泌,抑制率分别为97%和88%,RT-PCR结果显示HBV的mRNA表达降低,荧光定量PCR结果证实siRNA能降低HBVDNA拷贝数2个数量级。结论载体产生的针对HBVX基因的siRNA能高效、特异地抑制HBV基因的表达和复制。 相似文献
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目的观察转化生长因子β(TGF-β)不敏感、肿瘤细胞裂解物负载的树突状细胞(DC)疫苗对小鼠肾癌的治疗作用。方法利用修饰的TβRII粒构建逆转录病毒载体,转染肾癌Renca细胞裂解物负载的DC,获得表达显性负相TpRII(TpRIIDN)的DC,流式细胞仪测定细胞表型变化,观察TGF-β体外增殖抑制效果,Western blot检测SMAD-2的磷酸化水平。Renea细胞皮下荷瘤BALB/C鼠40只,随机分TβRIIN—DC组、DC-抗原组、DC组和对照组4组,每组10只,分别给予不同的皮下接种,观察肿瘤体积改变和小鼠生存期。结果经方差分析,TβRIIDN—DC组与DC-抗原组,DC、组的DC细胞CD86、CD80,CD40、CD11c及MHC-Ⅱ表型差异无统计学意义(P>0.05),TGF-β对TβRIIDN—DC细胞的增殖无抑制作用。在TβRIIDN—DC组未检测到磷酸化SMAD-2。TβRIIDN—DC组、DC抗原组、DC组和对照组的小鼠肿瘤体积分别为(36.27±13.09)、(115.51±20.75)、(218.10±18.93)和(239.21±21.82)mm^3,4组荷瘤小鼠生存期分别为(75.6±10.2)、(44.3±8.5)、(19.0±5.4)和(21.2±6.7)d,其中TβRIIDN—DC组2只小鼠肿瘤完全消失,TβRIIDN-DC组肿瘤体积及荷瘤小鼠生存期与其他各组比较差异均有统计学意义(P<0.01)。结论TGF-β不敏感的DC疫苗对肾癌荷瘤BALB/C小鼠有明显的免疫治疗作用。 相似文献
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目的 :探讨 p5 3基因在 GRC- 1肾癌细胞系中的作用途径和 p2 1 WAF1 /CIP1 在 wt-p5 3介导的细胞凋亡中的作用。方法 :使用脂质体共转染方法将 wt- p5 3与反义 p2 1 WAF1 /CIP1基因导入 GRC- 1肾癌细胞系中 ,对所获转染细胞进行细胞周期分析和阿霉素诱导细胞凋亡试验。结果 :在 wt- p5 3基因与反义 p2 1 WAF1 /CIP1 基因共转染后 GRC- 1肾癌细胞中 ,wt- p5 3基因的自发凋亡现象消失、亚致死量的阿霉素诱导下存活细胞数的增加。结论 :在 GRC- 1肾癌细胞中 ,wt- p5 3基因介导的细胞凋亡至少部分是通过 p2 1 WAF1 /CIP1 基因发挥作用。p2 1 WAF1 /CIP1基因可能作为一个与细胞凋亡的相关基因调控肾癌细胞的生与死 相似文献
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传统的教学模式偏重于灌输书本知识,忽视了对学生应用和实践能力的培养,使书本知识与临床问题不能有效结合。以问题为基础的学习(PBL)教学法是一种以学生为中心的教学方法,它强调以问题解决为中心,学生在教师的指导下,通过自主探究和合作解决问题,从而掌握隐藏于问题背后的知识点。高血压是一种病程长、并发症多的慢性疾病,它所涉及的知识点多,内容复杂。在高血压的教学中,使用PBL教学法结合典型病例,可以更有效地激发学生的学习积极性,有助于帮助学生全面地掌握高血压的相关知识,提高学生解决问题的能力,从而显著提高学习效果。 相似文献
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犬IGF-I编码区cDNA克隆及其序列分析 总被引:5,自引:1,他引:5
目的:克隆犬胰岛素样生长因子(IGF—Ⅰ)编码区基因,构建重组真核表达载体。方法:从犬左心室组织中提取总RNA,通过RT—PCR获取IGF—1 cDNA编码区全序列,将其与pcDNA3.1( )质粒载体连接,构建重组真核表达载体pcDNA3.1( )/IGF—1,转化大肠杆菌DH5α后,随机挑选数个克隆,提取质粒DNA,通过限制性酶切和核苷酸序列鉴定阳性克隆。结果:重组质粒pcDNA3.1( )/IGF—1的酶切图谱和序列分析结果与国外文献报道一致。结论:克隆到IGF—1编码区基因,成功构建重组真核表达载体pcDNA3.1( )/IGF—1。 相似文献