cTnI( 28-110aa)-linker-TnC融合蛋白基因的构建、表达及鉴定

目的构建及表达人cTnI（28-110aa）-linker-TnC融合蛋白。方法应用PCR技术从人心脏cDNA文库中扩增出cTnI（28-110aa）和TnC基因，通过引物设计在两者之间加上linker序列即编码19个中性氨基酸残基TS-（G4S）3-AC的序列，克隆PCR产物，并构建成pET28a-cTnI（28-110aa）-linker-TnC表达质粒，转化人大肠杆菌表达菌株BL21（DE3），用异丙基硫代-β-D-半乳糖苷（IPTG）诱导目的蛋白的表达，NTA树脂亲和层析纯化后检测其纯度和免疫反应性。结果成功构建了cTnI（28-110aa）-linker-TnC融合蛋白的基因，并在大肠杆菌中实现可溶性高表达，在摇瓶中的表达量为20mg／L．经一步NTA树脂亲和层析纯化，获得条带单一的目的蛋白，采用进口全自动免疫检测系统鉴定证实．目的蛋白有较高的免疫反应性。结论采用原核表达方法获得了具有高纯度和高免疫反应活性的cTnI（28-110aa）-linker-TnC融合蛋白。     

miR-125b通过靶向结合ETV6调控Hs578T的侵袭转移

目的 研究miR-125b在乳腺癌中的表达,尤其是其对乳腺癌迁移侵袭的作用以及该过程所涉及的分子机制。 方法 (1)用实时荧光定量PCR检测23对临床组织样本中miR-125b及靶基因ETV6的表达水平;(2)用实时荧光定量PCR、双荧光报告验证靶基因;(3)在细胞中瞬时转染miR-125b mimics,并用划痕、transwell迁移、侵袭及Western blot检测体外乳腺癌细胞的迁移侵袭能力及上皮间质转化的变化;(4)用靶基因敲减实验进一步验证靶基因的准确性。 结果 (1)与正常组织相比,乳腺癌组织中miR-125b的表达显著降低(P<0.001),ETV6的表达显著增高(P<0.05);(2) ETV6为miR-125b的靶基因;(3)与对照相比,上调的miR-125b可显著抑制Hs578T的迁移和侵袭(P<0.001),并抑制EMT的发生;(4)敲减ETV6对Hs578T的作用与miR-125b过表达一致。 结论 miR-125b在乳腺癌中低表达,miR-125b通过靶向结合ETV6 3’UTR抑制该基因的表达,从而抑制Hs578T的迁移、侵袭及上皮间质转化的发生。因此,miR-125b可作为抑癌基因发挥作用。      

人乳腺癌多耐药细胞株中ALDH1,P-gp及CD44v6的表达研究

目的:比较人乳腺癌亲代敏感株MCF-7和多耐药细胞株MCF-7/A中ALDH1,P-gp及CD44v6的表达差异,探讨多耐药与侵袭转移作用机制。方法:以阿霉素低浓度加量持续诱导法,建立人乳腺癌多耐药细胞模型株MCF-7/A,用ALDEFLUOR分析法检测乳腺癌干细胞功能性标志物ALDH1阳性细胞在亲代敏感株MCF-7与多耐药细胞株MCF-7/A中所占比例,Transwell侵袭实验论证乳腺癌胞耐药是否伴随相应侵袭转移能力的改变,免疫细胞化学染色及荧光定量PCR分析亲代敏感株MCF-7与多耐药细胞株MCF-7/A中MDR1(P-gp)和CD44V6的表达变化。结果:耐药细胞株MCF-7/A较亲代敏感株ALDH1阳性细胞比例数明显增高;耐药细胞株MCF-7/A穿膜细胞数明显多于敏感细胞株MCF-7;耐药细胞株MCF-7/A中P-gp和CD44v6表达均明显高于亲代敏感细胞株。结论:乳腺癌的多耐药不仅包含获得性耐药细胞比例增加,同时伴有肿瘤干细胞的富集造成的内在性耐药增加,耐药的乳腺癌细胞伴有侵袭能力增强。     

恒温扩增技术在肺结核诊断中的应用价值

目的通过比较恒温扩增技术（SAT）、GeneXpertMTB法和快速液体培养（BACTECTMMGITTM960System）检测结核分枝杆菌的技术特点,评估SAT在肺结核诊断中的应用价值。方法对108例疑似肺结核患者和15例非肺结核患者痰样本分别进行抗酸染色镜检、快速液体培养、GeneXpertMTB及SAT检测,分析比较这几种检测方法的特点。结果SAT、GeneXpertMTB、快速液体培养的阳性率分别为62.0%（67/108）和64.8%（70/108）、50.0%（54/108）;以临床诊断为标准,3者的灵敏度分别为65.7%（67/102）、68.6%（70/102）和47.1%（48/102）,特异度分别为100%（21/21）、100%（21/21）和71.4%（15/21）。结论SAT技术不仅简便快速,而且可以提高临床肺结核诊断的阳性率及灵敏度,对肺结核快速诊断有重要价值。     

谷胱甘肽S-转移酶-肌钙蛋白Ⅰ（28～110aa）表达纯化及稳定性的初步研究

目的：评估重组融合蛋白谷胱甘肽S-转移酶(GST)-肌钙蛋白Ⅰ(TnI)(28～110aa)的实用价值。方法：诱导表达菌株BL21-PGEX-4T-3/TnI(84～330bp)表达GST—TnI(28～110aa)，谷胱甘肽Sepharose-4B亲合层析柱纯化融合蛋白．经自动免疫分析仪检测其免疫反应性。采用双抗体夹心ELISA法检测稳定性，并与天然提纯心肌肌钙蛋白Ⅰ(cTnI)抗原进行比较。结果：GST-TnI(28～110aa)融合蛋白表达水平高，具较高免疫反应性。在37℃条件下，GST-TnI(28～110aa)融合蛋白第3天免疫反应性仍保留60％，而人心肌提纯的cTnI在第3天免疫反应性几近丧失。结论：GST-TnI(28～110aa)融合蛋白具较高的免疫反应性，与天然cTnI相比较，重组GST-TnI融合蛋白稳定性好，有望作为cTnI测定的候选参考标准品。     

人cTnI抗原性及测定标准化的研究进展

上个世纪90年代起。心肌肌钙蛋白(cTn)用于临床诊断心肌损伤．由于心肌肌钙蛋白Ⅰ(cTnI)可检出微小心肌损害，现已成为心肌细胞损伤敏感度和特异度最强的标志物之一，是快速诊断急性心肌梗死(AMI)和急性冠脉综合征(acute coronary syndromes．ACS)、协助ACS危险分级和反映其预后的主要生化标志。大量临床研究表明cTnI在诊断心肌损伤时有高度的特异度及灵敏度。是诊断心肌损伤的“金标准”。     

乳腺癌多药耐药细胞系MCF-7/A的建立

目的建立人乳腺癌多药耐药细胞系MCF-7/A,对其生物学特性进行初步分析评价,为后续乳腺癌多药耐药机制研究提供一株较理想的细胞模型.方法以阿霉素(ADM)为诱导药物,人乳腺癌细胞系MCF-7为诱导对象,采用ADM低浓度持续加量诱导方法,建立人乳腺癌多药耐药细胞系MCF-7/A,比较两组细胞形态变化和倍增时间,MTT法测定细胞耐药倍数及多药耐药指数,实时荧光定量PCR检测MDR1、MMP-2、CD44v6 mRNA表达水平.结果建成的MCF-7/A耐药细胞株,耐ADM指数为74,撤药培养60d后耐药指数仍维持在50以上,耐药性稳定,并与多种化疗药物有交叉耐药性,MCF-7/A耐药细胞株撤药培养倍增时间较亲本细胞明显缩短,MDR1、MMP-2、CD44v6 mRNA表达水平较亲本细胞均有明显增加(均P<0.01).结论建立的MCF-7/A模型具有多药耐药细胞的基本生物学特性,可用于乳腺癌多药耐药及侵袭转移机制的研究.     

抗中性粒细胞胞浆抗体与抗核抗体联合检测在系统性红斑狼疮中的临床意义

目的:探讨系统性红斑狼疮(SLE)患者血清中抗中性粒细胞胞浆抗体(ANCA)及抗核抗体(ANA)联合检测的临床意义。方法:采用间接免疫荧光技术(IIF)检测并回顾性分析84例SLE患者和52例健康体检者(正常对照组)血清ANCA阳性率及荧光免疫模型,同时采用酶标免疫吸附法(ELISA)进行抗核抗体(ANA)检测。结果:84例SLE患者中,ANCA阳性28例(33.3%),正常对照组无ANCA阳性。28例AN-CA阳性组中,狼疮活动18例(64%),56例ANCA阴性组中狼疮活动22例(39.3%),两组阳性率差别有统计学意义(P<0.01);84例SLE患者中ANA检出58例(69.0%),正常对照组52例中2例ANA阳性,阳性率为(3.84%)。ANCA与ANA联合检测,ANCA阳性ANA阳性共70例,敏感性为83.3%,显著高于两者单独检测时的敏感性(P<0.01)。结论:联合ANCA、ANA检测有助于提高SLE的诊断的敏感性,ANCA与狼疮活动力具有相关性。     

肌钙蛋白Ⅰ(28～110aa)-C复合物的表达纯化及抗体制备

心肌肌钙蛋白Ⅰ(cTnI)是诊断急性心肌梗死的"金标准"[1-2].心肌损伤时,外周血中90%以上的cTnI以I-C复合物形式存在[3-4],而28～110间的肽段与C形成复合物稳定,我们根据患者血清中cTnI存在形式,通过引物设计构建pGEX4T-3-cTnI(28～110aa)-C原核表达系统,在大肠杆菌中实现cTnI(28～110aa)-C复合物的稳定可溶性高表达.然后,用该融合蛋白抗原制备抗cTnI单克隆抗体及多克隆抗体,为建立检测方法,提高检测灵敏度做前期准备.