沉默视黄酸核受体α损伤大鼠原代海马神经元的钙兴奋性

目的:了解视黄酸核受体α (RARα)对大鼠神经元功能的必要性.方法:采用组织消化原代贴壁法分离培养大鼠原代海马神经元,利用腺病毒载体特异沉默RARα;利用Real-Time PCR分析沉默RARα对神经元视黄酸(RA)信号各受体以及神经细胞标志物的影响;利用活细胞钙影像分析沉默RARα对神经元钙兴奋性的影响.结果:免...     

重组腺病毒介导的骨形态发生蛋白-9对小鼠胚胎肝脏干细胞诱导分化的影响

目的探讨重组腺病毒介导的骨形态发生蛋白-9(Adv-BMP-9)诱导小鼠胚胎肝干细胞向成熟肝细胞定向分化的影响。方法将已构建的表达BMP-9、肝细胞生长因子(HGF)和绿色荧光蛋白(GFP)的重组腺病毒,分别感染小鼠胚胎肝干细胞,诱导其分化,然后采用半定量PCR、Real-time PCR、细胞免疫荧光、荧光素酶报告基因检测等方法检测甲胎蛋白(AFP)、白蛋白(ALB)和细胞角蛋白18(CK18)等肝细胞标志物的表达。结果半定量及Real-time PCR检测,诱导7 d后的BMP-9组、HGF组AFP的mRNA表达△△Ct值分别为(0.027±0.003)、(0.023±0.002),较GFP对照组(0.103±0.018)显著下降,ALB的mRNA表达△△Ct值分别(0.041±0.005)、(0.031±0.001),较GFP对照组(0.013±0.002)明显升高,CK18的mRNA表达△△Ct值分别(0.094±0.003)、(0.083±0.007),较GFP对照组(0.040±0.008)明显升高(P<0.05);细胞免疫荧光染色,诱导7 d后的细胞胞浆内表达肝细胞特有的ALB、CK18等蛋白,而对照组几乎无表达;荧光素酶报告基因检测,诱导1、4、7 d的BMP-9组、HGF组的ALB表达荧光素酶A值分别[(5 509.35±213.08),(33 198.14±666.39),(50 815.03±1 730.75)]、[(5 539.25±132.62),(31 400.71±2 622.39),(49 088.28±1 868.03)],较GFP对照组(4 732.49±68.22),(9 407.71±487.84),(20 894.83±1 100.54)明显升高(P<0.05)。结论 BMP-9有诱导小鼠胚胎肝脏干细胞向成熟肝细胞样细胞分化的作用,并且BMP-9对小鼠胚胎肝干细胞的诱导分化作用甚至和传统的肝干细胞诱导分化因子HGF相当。     

PPARγ2基因重组腺病毒载体的构建与鉴定

目的 构建携带PPARγ2基因的腺病毒载体.方法 采用PCR技术从pcDNA3质粒中扩增小鼠PPARγ2基因,将PPARγ2基因亚克隆至质粒穿梭载体pAd-Track-CMV.用脂质体(lipid body)转染法(infection protocol)将重组腺病毒pAd-Track-PPARγ2-CMV和pAdEas-1共转染293细胞,确定转染效率.结果 RT-PCR检测结果显示腺病毒Ad-PPARγ2PCR产物约为470bp;用抗PPARγ2单克隆抗体进行Western blot检测为阳性,感染的重组腺病毒载体在L02细胞中PPARγ2有较高的稳定表达.结论 成功构建携带小鼠PPARγ2基因的腺病毒载体.