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目的:从蛋白质可逆磷酸化修饰的角度初步勾勒出CCKB型受体介导的胞内信号转导途径。方法:培养的小鼠大脑皮质神经元分为实验组、对照组和受体拮抗剂组,在无磷培养基加入 [32P]-NaH2PO4标记细胞中的磷蛋白后,刺激组给予CCK8(10-7 mol/L),对照组加入等量的无磷培养基,受体拮抗剂组在分别加入CCKA型、CCKB型受体拮抗剂L364 718、L365 260以及L364 718+L365 260,浓度均为10-8 mol/L,孵育10 min后,再加入10-7 mol/L CCK8,37 ℃作用60 min,液氮中终止磷酸化反应。裂解细胞提取蛋白质,双向电泳分离,放射自显影7d后,获得磷酸化蛋白的放射自显影双向电泳图谱。采用PDQuest 2D分析软件对图谱进行差异分析,并在Swiss-Prot蛋白质数据库和自建磷蛋白数据库中查询定性。结果:CCK8作用60 min后,小鼠神经元CCK8信号转导相关磷酸化蛋白有:多种蛋白激酶、细胞信号分子、生长因子受体、转录因子等。加入L364 718后,神经元中PKCδ、P55G等的磷酸化水平降低,加入L365 260后, PKCα、PKGβ、OGFR、EGFR等的磷酸化水平呈现不同程度的降低,表明皮质神经元中CCKB受体介导的信号转导更复杂。结论:CCKA型、GGKB型受体均可介导CCK8在神经元的信号转导,但CCKB型受体可能发挥了更重要的作用,其介导的信号途径可能包括:肌醇磷脂信使系统、cAMP-PKA途径、MAPK途径、JNK途径、PI3K-PKB途径和cGMP-PKG途径。 相似文献
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目的观察曲古抑菌素A(TSA)的体外抗人肝癌HepG2细胞作用及机制。方法取人肝癌HepG2细胞培养至对数生长期后随机分为TSA组、对照组、空白组,TSA组加入TSA至终浓度分别为125、250、500、1 000、2 000nmol/L,对照组加入等量二甲基亚砜(DMSO),空白组只加培养基、无细胞,每组设6个复孔,作用24~72 h后MTT比色法测定HepG2细胞增殖抑制率(IR),倒置显微镜和电镜观察HepG2细胞形态变化,TUNEL法检测细胞凋亡率,实时荧光定量PCR检测脆性组氨酸三联体(FHIT)基因表达,Western blot检测FHIT蛋白表达。结果与对照组相比,TSA组IR随TSA浓度增加和作用时间延长而增加(P〈0.05),透射电镜下TSA组HepG2细胞出现凋亡早期改变;与对照组比较,TSA组细胞凋亡率升高,FHIT mRNA及蛋白表达增强(P均〈0.01)。结论 TSA体外能有效抑制肝癌细胞株HepG2生长并促进其凋亡,机制可能为上调FHIT表达。 相似文献
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目的:建立检测人脆性组氨酸三联体(fragile histidine triad,FHIT)基因的荧光定量RT-PCR方法。方法:根据GenBank中人FHIT基因序列,在保守区设计合成一对特异引物,将PCR扩增得到的FHIT基因克隆至PMD18-T载体上,构建的重组质粒标准品倍比稀释后运用SYBR Green I染料法绘制标准曲线,并进行融解曲线分析。结果:FHIT基因的标准品稀释度在1×107~1×103copies/μl范围内具有良好的线性关系,Ct值线性范围为14.28~28.36,相关系数为0.998,融解曲线分析表明,产物为特异的单峰,Tm为92.3±0.1℃。结论:建立了人FHIT基因实时荧光定量RT-PCR方法,为在mRNA水平对人FHIT的定量分析奠定了基础。 相似文献
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槲皮素对LPS延迟中性粒细胞自发性凋亡效应的抑制作用 总被引:20,自引:0,他引:20
目的:研究槲皮素对接受细菌脂多糖(LPS)刺激的中性粒细胞(PMN)自发性凋亡的影响,探讨槲皮素的抗炎作用机制。方法:以人外周血PMN为研究对象,选择光镜和流式细胞术检测细胞凋亡情况,对裂解的片段化DNA进行定量(二苯胺测定法)和定性(琼脂糖凝胶电泳)分析。结果:槲皮素(1~100μmol/L)对PMN的自发性凋亡率并无影响,但却能部分恢复由LFS所延迟的PMN自发性凋亡进程。当槲皮素的浓度为40μmol/L时,其恢复作用达到最大。结论:槲皮素对LPS延迟PMN自发性凋亡的效应产生了抑制作用,减轻了因预激因子活化PMN而加重的炎症反应,部分揭示了槲皮素的抗炎作用机制。 相似文献
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目的 探讨八肽胆囊收缩素(CCK-8)对糖尿病大鼠胰岛细胞损伤的保护作用.方法 检测CCK-8对链脲佐菌素(STZ)致糖尿病大鼠模型的刺激前后血糖和血清胰岛素的水平,采用双向电泳并结合生物信息学方法,观察刺激前后胰腺组织蛋白质表达的差异.结果 初步确定了CCK-8刺激引起胰岛细胞JIP1、RBBP7、PP2AB、PDX1、BCLX 5种蛋白质的表达明显增强,这些蛋白在促进细胞增殖、抑制细胞凋亡、刺激胰岛素基因表达等方面发挥重要作用.结论 CCK-8可能通过刺激特异蛋白质的表达,对糖尿病大鼠受损胰岛细胞起到一定的保护和恢复作用. 相似文献