酪氨酸激酶抑制剂E7080治疗大鼠脉络膜新生血管的实验研究

目的探讨酪氨酸激酶抑制剂E7080对实验大鼠脉络膜新生血管(CNV)的抑制作用。 方法成年雄性棕色挪威大鼠60只，由北京维通利华实验动物公司提供。采用数字表法将大鼠随机分为对照组、E7080低剂量组(10 mg·kg^-1·d^-1)及E7080高剂量组(20 mg·kg^-1·d^-1)，每组各20只。采用激光诱导实验大鼠形成CNV，以完成动物模型的制作。7 d后，按不同分组给药干预。分别于造模后7 d及给药后7 d、14 d采用荧光素眼底血管造影检查CNV形成与荧光渗漏的情况。分别于给药后7 d和14 d，采用组织病理学的方法评估CNV的病理情况。分别于造模后7 d及给药后14 d，采用视网膜色素上皮层-脉络膜-巩膜复合体铺片植物凝集素B4染色观察CNV的面积。CNV荧光信号的强度、CNV荧光信号的厚度以及凝集素B4染色的CNV面积，以均数±标准差进行描述。多组样本间不同组间均数的比较，采用重复测量资料的方差分析，采用LSD检验进行两两比较。 结果荧光素眼底血管造影的检查结果显示，给药7 d后，低剂量组和高剂量组实验大鼠CNV相对渗漏荧光信号的强度分别为(0.5378±0.0967)和(0.3774±0.086)，均低于对照组的(0.6752±0.095)，差异具有统计学意义(t＝6.342，13.99；P<0.05)；给药14 d后，低剂量组和高剂量组的CNV相对渗漏荧光信号强度分别为(0.5735±0.0726)和(0.4071±0.1197)，也均低于对照组(0.7305±0.0924)，差异有统计学意义(t＝6.92，14.50；P<0.05)。苏木精-伊红染色结果显示，药物处理7 d后，低剂量组和高剂量组的CNV厚度分别为(84.14±8.829)μm和(77.23±9.365)μm，均低于对照组的(125.3±18.18)μm，差异具有统计学意义(t＝7.38，8.628；P<0.05)；药物处理14 d后，低剂量组和高剂量组的CNV厚度分别为(86.21±10.51)μm和(77.88±7.39)μm，均低于对照组的(147.9±19.66)μm，差异具有统计学意义(t＝9.656，10.44；P<0.05)。视网膜色素上皮层-脉络膜-巩膜复合体铺片荧光染色显示，低剂量组和高剂量组实验大鼠CNV的平均面积分别为(18 991±8665)μm²和(20 083±11 759)μm²，均低于对照组的(51 156±24 348)μm²，差异具有统计学意义(t＝ 6.039，6.593; P<0.05)，在用药不同浓度之间的差异无统计学意义(t＝0.2174，P>0.05)。 结论口服酪氨酸激酶抑制剂E7080可以抑制激光诱导的大鼠CNV的形成及相关的病理损害。     

牵拉力对人小梁网细胞活性及房水流出调节功能影响的实验研究

 目的 观察强机械牵拉力作用下，人小梁网细胞活性及房水流出调节相关基因表达的改变。设计 实验研究。 研究对象 人小梁网细胞。方法 依据牵拉力作用时间将原代培养的小梁网细胞分为0 h对照、12 h、24 h三组。采用FLEXCELL力学加载设备对体外培养的人小梁网细胞施加最大延伸比例为22%的机械牵拉力。用流式细胞学的方法检测各组小梁细胞的凋亡比率，采用蛋白印迹法检测细胞存活相关蛋白的表达，用定量聚合酶链式反应（qPCR）检测与房水流出调节相关的15个基因在牵张力作用下的表达量，并比较实验组与对照组间的差异。主要指标 小梁网细胞凋亡率、整合素-Fak信号通路相关分子、房水流出调节相关的15个基因的表达量。结果 在牵拉力作用后，对照组、12 h组、24 h组的凋亡率分别为0.71%±0.18%、0.77%±0.19%、0.87%±0.31%（P=0.7298）；三组磷酸化Akt蛋白的相对表达量分别为1.00、2.17±0.06、1.69±0.07（P<0.01）；整合素信号通路中的磷酸化Fak的相对表达量分别为1.00、1.85±0.09、1.31±0.08（P<0.01）。此外，参与调节房水流出的基质金属蛋白酶1、2、3、7、9、10、11、12、14基因表达均升高（P均<0.01）；基质金属蛋白酶抑制剂1、2、3基因的表达均降低（P均<0.01）；白介素6基因相对表达量分别为1.00、1.28±0.06、1.47±0.06（P<0.01）。结论 高强度的机械牵拉能够增加小梁网细胞的活性，增强房水流出调节相关因子的表达，这可能是schlemm管成形术降低眼压的机制之一。     

自身免疫性视网膜病变小鼠模型的建立及评价

目的 诱导自身免疫性视网膜病变（AIR）小鼠模型,对其发生过程、病理及功能特征进行评价。设计 实验研究。 研究对象 18只7~9周鼠龄C57BL/6J小鼠用于诱导AIR发生;同龄同种小鼠6只设立为对照组。方法 用完全弗氏佐剂（CFA）乳化的小鼠重组恢复蛋白（recoverin）（CFA-recoverin）免疫小鼠作为诱导组,用CFA-PBS注射小鼠作为对照组。在免疫后的第0天和第2天注射百日咳毒素（PTX）破坏血-视网膜屏障。利用蛋白印迹法分析、 多模态影像检测及组织病理学方法评价造模指标。主要指标 诱导后3、6、8周小鼠血清recoverin抗体的表达、裂隙灯检查、彩色眼底照相、OCT、FFA或视网膜电图（ERG）的表现及视网膜组织学染色特征。结果 诱导组小鼠在第3周出现血清recoverin抗体阳性;第6周抗体表达明显增加并开始出现双眼少量视网膜黄白色病灶,OCT示外层视网膜轻度受损;第8周视网膜浸润灶明显扩大,OCT显示外层视网膜连续性明显破坏。第8周FFA显示病灶区视网膜下明显荧光渗漏;ERG示视杆及视锥反应波振幅显著降低。第6周及第8周病理学显示不同程度外层视网膜结构破坏及炎性细胞浸润。结论 重组recoverin蛋白皮下注射可成功诱导小鼠AIR发生,其眼部表现及病理学特征与AIR患者大致相似,是进行AIR研究的良好工具。（眼科,2023,32： 142-147）     

水凝胶角膜给药载体治疗大鼠角膜炎的实验观察

目的观察水凝胶角膜给药载体对大鼠角膜炎的治疗效果。方法建立金黄色葡萄球菌角膜炎动物模型,SD大鼠随机分为5组:分子印迹聚甲基丙烯酸-β-羟乙酯与甲基丙烯酸的共聚物P(HEMA-CO-MAA)水凝胶角膜给药载体组、聚甲基丙烯酸-β-羟乙酯与甲基丙烯酸的共聚物P(HEMA-CO-MAA)水凝胶角膜给药载体组、聚甲基丙烯酸-β-羟乙酯(PHEMA)水凝胶角膜给药载体组、加替沙星眼药水组、自愈组,每组各3只,分组进行饲养。比较各组角膜结膜情况并进行角膜细菌划线培养和病理组织学观察。结果角膜炎大鼠干预后48 h进行检测,自愈组划线细菌培养与干预前无明显差别,PHEMA组划线菌落培养少于干预前,而加替沙星眼药水组、P(HEMA-CO-MAA)组及分子印迹P(HEMA-CO-MAA)组划线菌落培养明显少于干预前。角膜冰冻切片行HE染色,各组均可见水肿,相对于眼药水组,P(HEMA-CO-MAA)及分子印迹P(HEMA-CO-MAA)水凝胶角膜给药载体组角膜基质水肿程度较弱,炎症浸润细胞较少。结论 P(HEMA-CO-MAA)和分子印迹P(HEMA-CO-MAA)水凝胶角膜给药载体比PHEMA水凝胶角膜给药载体杀菌效果强,更具有未来长效缓释的研究价值。     

CIZ1基因通过调控MEK-ERK1-2信号通路影响视网膜母细胞瘤细胞增殖和凋亡的实验研究

目的探讨锌指蛋白(CIZ)1基因影响视网膜母细胞瘤(RB)细胞增殖和凋亡的机制。 方法RB组织芯片购自西安艾丽娜生物科技有限公司，人神经母细胞瘤细胞系Y79购自美国ATCC公司。应用免疫组化方法检测CIZ1基因在RB肿瘤组织和正常视网膜组织中的表达情况；应用荧光定量聚合酶链式反应(PCR)和Western blot方法检测CIZ1基因在RB细胞中信使核糖核酸(mRNA)和蛋白的表达水平。选取RB细胞系Y79细胞，采用数字表法随机分为对照组、干扰CIZ1基因组(shCIZ1)-1及shCIZ1-2等3组。采用不同的慢病毒分别感染阴性对照组和两组shCIZ1基因组细胞。应用荧光定量PCR及Western blot方法检测敲低效率；应用细胞增殖测量试剂盒(CCK8)方法检测细胞的生长、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(caspase)3-7的活性和细胞凋亡相关蛋白表达的情况；通过Western blot方法检测丝裂原活化蛋白激酶激酶(MEK)-细胞外调节蛋白激酶(ERK)1-2信号通路相关蛋白的表达变化。CIZ1的基因表达量、蛋白表达水平、RB细胞的增殖倍数、Caspase3-7、MEK、p-MEK、ERK及p-ERK蛋白的表达水平，采用单样本K-S拟合优度法进行正态性检验，符合正态分布者以均数±标准差进行描述。多组样本间不同组间均数的比较采用重复测量资料的方差分析，采用LSD检验进行两两比较。 结果与正常视网膜组织相比，CIZ1基因在RB肿瘤组织中的表达水平显著上调；在RB细胞中，CIZ1基因mRNA水平及蛋白水平均显著高于正常人视网膜色素上皮细胞(ARPE)，Y79细胞、人神经母细胞瘤细胞系(WERI-Rb)-1细胞中mRNA相对表达量分别为(0.061±0.001)、(0.041±0.001)，与ARPE19细胞中mRNA相对表达量(0.025±0.001)相比，差异均具有统计学意义(t＝41.58，18.68；P<0.05)；慢病毒干扰CIZ1基因的表达可以显著降低CIZ1的mRNA与蛋白表达水平，shCIZ1-1组和shCIZ1-2 CIZ1组mRNA的相对表达量分别为(0.015±0.008)和(0.008±0.003)，与对照组mRNA的相对表达量(0.032±0.003)相比，差异均具有统计学意义(t＝3.72，5.357；P<0.05)；敲低CIZ1基因可以显著抑制RB细胞的增殖，也可以抑制增殖相关基因即细胞周期蛋白(Cyclin)D1蛋白的表达，与对照组相比差异有统计学意义(t＝21.18，21.80；P<0.05)；同时还可以抑制增殖相关基因Cyclin E1蛋白的表达，与对照组相比差异有统计学意义(t＝17.26，16.41；P<0.05)。敲低CIZ1可以显著增强细胞凋亡相关蛋白Caspase3-7的活性，上调Caspase-3和Caspase-7蛋白的表达。Western blot检测敲低CIZ1基因对MEK-ERK1-2信号通路影响的结果显示，CIZ1下调可以显著抑制磷酸化的MEK的表达水平，与对照组相比差异具有统计学意义(t＝3.925，8.461；P<0.05)；CIZ1下调可抑制ERK1-2蛋白的磷酸化水平，与对照组相比差异具有统计学意义(t＝14.12，28.36；P<0.05)。 结论敲低CIZ1基因可以通过抑制MEK-ERK1-2信号通路抑制RB的生长。     

广谱机械力敏感离子通道抑制剂钌红调控眼压的实验研究

目的 研究广谱机械力敏感离子通道抑制剂钌红对眼压的调控作用。设计 实验研究。研究对象 人原代小梁网细胞、C57BL/6J小鼠（2月龄）10只。方法 分离培养人原代小梁网细胞，通过细胞形态和免疫荧光技术鉴定细胞类型；利用膜片钳技术记录机械力刺激下小梁网细胞机械力敏感电流的变化，并观察广谱机械力敏感离子通道抑制剂钌红对电流的抑制作用；将10只小鼠随机分为2组（每组5只）：第1组（对照组）小鼠双眼前房内分别注射2 μl生理盐水，第2组（钌红组）小鼠双眼前房内分别注射2 μl 20 μM钌红。注射前日测量基础眼压，注射后每日测量眼压，并于注射12天后在小鼠每眼的前房设定15、25、35 mmHg压力下各灌注15 min生理盐水的方式测量房水流畅系数及注入速率。主要指标 机敏电流（pA）、眼压（mmHg）和房水流畅系数（μl/min/mmHg）。结果 钌红组给药后机械力敏感电流（-67.6 ± 30.2 pA）显著低于给药前（-309.7 ± 65.9 pA）（P=0.003）；注射10天后，钌红组眼压为（14.67±2.11）mmHg，低于生理盐水组（17.85±3.66 mmHg）（P=0.0604）；注射12天后，钌红组房水流畅系数（0.01058±0.00236 μl/min/mmHg）明显低于生理盐水组（0.00324 ± 0.00135 μl/min/mmHg）（P=0.0273）；灌注压为15 mmHg时，钌红组注入速率（0.37±0.15 μl/min）高于生理盐水组（0.28±0.05 μl/min）（P=0.6278）。结论 钌红有效抑制人小梁网细胞机械力敏感电流，降低小梁网房水引流功能；同时，钌红也可有效抑制房水生成速率，为青光眼治疗提供新思路。     

NOX2基因缺陷对rd1小鼠感光细胞凋亡的保护作用

目的 观察NADPH氧化酶2(NOX2)基因缺陷对遗传性视网膜变性小鼠1(rd1)感光细胞的保护作用。设计 实验研究。研究对象 出生后14天的NOX2基因缺陷rd1小鼠(实验组)6只及同龄NOX2基因缺陷的C57BL/6N小鼠(对照组1)、无NOX2基因缺陷的rd1小鼠(对照组2)、C57BL/6N野生正常小鼠(对照组3)各6只(共24只)。方法 对照组1与对照组2小鼠多次交配获得实验组小鼠并进行基因型鉴定。取该实验鼠及对照组小鼠眼球,对视网膜进行HE染色并测量视网膜外核层厚度,TUNEL染色并计算凋亡细胞占外核层细胞总数百分比、免疫荧光法CD1 1b抗体标记小胶质细胞并检测NOX2主要亚单位gp91^pbox蛋白的表达。主要指标 视网膜外核层厚度,感光凋亡细胞百分比,gp91^pbox蛋白的表达量,小胶质细胞活化情况。结果 与同龄对照组2相比,实验组小鼠视网膜内外核层排列整齐,其外核层厚度(36.18±2.59)μm明显大于对照组2小鼠(21.45±1.33)μm(t=8.77,P=0.001)。实验组小鼠视网膜凋亡细胞主要出现于外核层,但数量...     

牵拉力对RPE细胞分泌VEGF影响的实验研究

目的 观察牵拉力诱导下RPE细胞血管内皮生长因子（VEGF）的表达及两者之间的关系。设计 实验研究。研究对象 ARPE-19细胞株。方法 应用Flexcell-5000应力加载系统牵拉3D-RPE模型。根据不同大小牵拉力分为对照组（无牵拉力组）、A组（20% 形变组）、B组（10%形变组）、C组（5%形变组）。各组依照不同的时间点收取样本进行检测。应用实时荧光定量PCR检测各组不同时间点（0、24、48 h）VEGFA mRNA的表达情况， 蛋白印迹法检测（0、24、48 h）VEGFA-165的表达以及ELISA方法检测（0、12、24、36、48 h）细胞上清液中VEGFA的分泌。同时，为了体外定量检测细胞VEGF的促新生血管形成能力，使用人脐静脉内皮细胞（HUVEC）进行了体外成管实验（24、48h）。主要指标 VEGFA mRNA相对表达量、VEGFA-165相对表达量、细胞上清液VEGFA分泌量、HUVEC成网数。结果 与对照组比较，A、B和C组在24 h（F=7.99，P=0.009）和48 h（F=75.09，P=0.000）的VEGFA mRNA表达均显著高于对照组，且B组VEGFA mRNA相对表达量在任意时间点均高于A组和C组（P均<0.05）。受牵拉力的三组的VEGFA-165蛋白相对表达量在24 h（F=51.62，P=0.000）和48 h（F=91.69，P=0.000）明显高于对照组。其中，B组VEGFA-165蛋白相对表达量在24 h（0.794±0.045）分别是A组的1.3倍（P=0.012）和C组的1.2倍（P=0.043），且在48 h（1.192±0.042）VEGFA-165蛋白相对表达量分别是A组的1.4倍（P=0.0001）和C组的1.3倍（P=0.0001）。随着时间延长，在24 h（F=131.16，P=0.0001）、36h（F=66.56，P=0.0001）和48 h（F=605.19，P=0.0001）A、B和C组细胞上清液VEGFA浓度明显高于对照组。体外成管实验中，48 h受牵拉力各组成网数均显著高于对照组（F=13.13，P=0.002），而24 h仅B组成网数有明显升高（P=0.029）。结论 牵拉力可诱导RPE细胞VEGF过表达，且具有时间效应和潜在的促新生血管形成的功能。