汉坦病毒A9株全长L片段cDNA克隆和核苷酸序列测定

目的克隆我国分离的汉坦病毒A9株L片段全长cDNA,并测定其核苷酸序列.方法用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)技术分段扩增汉坦病毒A9株全部L片段,用T-A克隆方法进行PCR产物克隆,测定PCR产物的核苷酸序列.通过亚克隆将分段的L片段连接成全长cDNA克隆.结果A9株的基因组L片段长度为6533个核苷酸,腺嘌呤核苷酸和尿嘧啶核苷酸丰富(%A+U=62.47).包含有一个单一的开放读码框架(ORF),编码一个标准的质量为2.46×105的蛋白,含有2151个氨基酸.A9株与76-118、C1-1和C1-2株的同源性最高,达到83.8%.与TULA病毒的关系较远,其核酸序列的同源性为65.8%.将推导的A9株编码的氨基酸序列与其他21种负链RNA病毒的依赖RNA的RNA聚合酶的氨基酸序列以及汉坦病毒几个代表株的L片段氨基酸序列进行比较,显示A9编码的RNA聚合酶也有6个比较保守的区域以及几个极端保守的氨基酸残基.结论汉坦病毒A9株L片段具有和其他汉坦病毒RNA聚合酶相似的核苷酸一级结构,通过对推导的氨基酸分析,该片段具有一些在RNA病毒聚合酶中都存在的保守区域.     

发热伴血小板减少综合征病毒在巨噬细胞中的亚细胞定位

目的 发热伴血小板减少综合征病毒(SFTSV)是新发传染病发热伴血小板减少综合征的致病病原,为布尼亚病毒科白蛉病毒属一种新型病毒.通过研究发热伴血小板减少综合征病毒在巨噬细胞中的亚细胞定位,了解SFTSV在细胞内的复制组装机制.方法 应用两种人源巨噬细胞系THP-1细胞和U937细胞,通过免疫荧光共聚焦方法分析SFTSV感染巨噬细胞后与高尔基体和内质网的共定位.结果 SFTSV可特异性感染巨噬细胞,在SFTSV感染的巨噬细胞中SFTSV核蛋白与高尔基体共定位于核周,与内质网紧密相邻,但没有共定位.结论 在SFTSV感染的巨噬细胞中,内质网和高尔基体可能是病毒进行加工修饰及包装成熟的重要场所.     

登革3型病毒义乌流行株免疫原性研究

目的对2009年浙江省义乌市暴发流行的登革3型病毒进行系统进化分析并初步研究其E蛋白的免疫原性。方法 RT-PCR扩增义乌分离株全基因组,利用MEGA 4分别构建E及NS1区域核苷酸及氨基酸系统发生树,进行系统进化分析。构建重组质粒JESS-ywD3prM/E397JEV-pcDNA5,IFA及Western Blot检测E蛋白在293T细胞中的表达及分泌情况。将纯化后的分泌性E蛋白免疫BALB/c小鼠,通过ELISA、中和试验等方法对体液免疫进行测定。结果登革3型病毒义乌分离株与广州GZ1D3株及印度GWL-25株核苷酸及氨基酸序列同源性均达到99%以上;其分泌性E蛋白可以刺激小鼠产生登革特异性IgG抗体及针对同型病毒的中和抗体。结论义乌分离株属于登革3型病毒亚型Ⅲ,其分泌性E蛋白具有一定的免疫原性。     

登革2型病毒ZS01/01株E蛋白在真核细胞中的分泌表达研究

目的 对登革2型病毒(DENV-2)ZS01/01株E蛋白在哺乳动物细胞及昆虫细胞中的分泌表达进行研究.方法 RT-PCR扩增DENV-2 prM/E基因,通过融合PCR在prM基因前添加来自乙型脑炎病毒的信号肽序列,并将E基因羧基末端20%区域缺失或替换为乙型脑炎病毒SA14-14-2株E基因相应序列,将上述基因元件分别克隆入哺乳动物细胞表达载体pcDNA5/FRT及昆虫细胞表达载体pAcUW51-M中,将重组质粒转染293T细胞或S19细胞,利用间接免疫荧光(Immunofluoreseence assay,IFA)及Western Blot检测E蛋白的表达与分泌.结果 各重组质粒分别转染293T细胞或Sf9细胞后,E蛋白在细胞内均有效表达,而仅有携带乙脑信号肽且缺失或替换E基因羧基末端20%区域的重组质粒转染293T细胞后,上清中可检测到明显的E蛋白分泌.结论 信号肽及E基因羧基末端20%区域对登革病毒E蛋白的分泌至关重要,宿主细胞对其亦有一定影响.     

Expression and function analysis of dengue virus type 1 to 4 envelope domain Ⅲ recombinant fusion protein

Objecfive To observe the ability of dengue virus type 1-4 envelope domain Ⅲ fusion protein to inhibit virus infection and analyze the neutralizing ability of polyclonal antibodies against rEⅢ.Methods After being connected by linker peptide.EⅢ protein of Dengue virus serotypes 1-4 were expressed in E coli BL21(DE3) then purified.Fusion proteins were verified by Western Blot and ELISA.Rabbits were immunized with fusion proteins to produce anti-rE Ⅲ serum.The activity of anti-rEⅢ serum were detected through indirect immunofluorescence assay test.Inhibition of dengue virus type 1 to 4 infection in BHK-21 cells by rEⅢ fusion protein were tested.Neutralizing activity of anti-rEⅢ serum was analyzed.Results Dengue virus type 1 to 4 envelope domain Ⅲ recombinant fusion protein was expressed in Ecoli BL21 and purified successfully.Then rEⅢ fusion protein and anti-rEⅢ serum were analyzed respectively and rEⅢ fusion protein can effectively inhibit dengue virus type 1 to 4 from infecting BHK cells.The anti-rE Ⅲ serums can neutralize dengue virus type 1 to 4 but with different neutralizing titer.Conclusion Dengue virus type 1-4 envelope domain Ⅲ fusion protein can directly inhibit DV infeetion.Antibodies induced by rE Ⅲ fusion proteins can neutralize dengue virus type 1-4.     

一种寨卡病毒富集检测方法的性能评价

  目的  对一种无需核酸提取纯化的寨卡病毒实时荧光定量反转录PCR检测方法的性能进行评价。  方法  该检测方法基于实时荧光定量反转录PCR技术, 样本处理采用病毒富集法: 取100~200 μL待测样本, 加入112~224 μL样本处理液Ⅰ, 5~10 μL样本处理液Ⅱ, 混匀后进行离心富集(12 000 r/min, 离心半径8.6 cm, 离心5 min)。离心后弃上清液, 加入20 μL复溶缓冲液重悬沉淀; 取10 μL重悬液, 加入50 μL PCR反应液上机检测。从定量检测下限、交叉反应、抗干扰性、精密度方面评价该检测方法的性能。收集北京协和医院检验科临床样本(血清、尿液、唾液样本), 随机选取约1/5构建寨卡病毒感染模拟临床样本, 进一步评定该检测方法的性能。  结果  该检测方法对MR766、ZKC2/2016毒株的检测下限均为10¹半数组织培养感染剂量(50% tissue culture infective dose, TCID50)/mL; 对17种常见虫媒病原体检测结果均为阴性, 无交叉反应发生; 潜在干扰物质胆红素(15 mg/L)、血红蛋白(100 mg/L)、甘油三酯(2000 mg/L)、IgG(37.5 g/L)和EDTA-Na₂(2.5 g/L)对其检测结果无干扰; 检测低、中、高浓度寨卡病毒的批次内和批次间Ct值变异系数均＜10%, 精密度良好。共收集344份北京协和医院检验科临床样本, 其中构建寨卡病毒感染模拟临床样本73份。采用该检测方法对344份样本进行检测, 结果均与实际相符, 无假阳性和假阴性。  结论  寨卡病毒简单富集后再检测的方法特异性高、重复性好, 检测结果不受干扰物质的影响, 检测下限满足临床需求, 且操作简便, 但应用效果仍需在真实临床样本中进一步验证。     

登革Ⅰ型病毒E蛋白在293T细胞中的分泌表达

目的 分泌表达登革Ⅰ型病毒prM/E基因,为研究该蛋白的免疫学功能和特性奠定基础.方法 用RT-PCR法获得登革Ⅰ型病毒广州分离株全长prM/E基因,在prM基因前添加乙型脑炎病毒的信号肽或同时替换E基因羧基末端的20%为乙脑病毒E基因相应的部分,分别将其克隆入真核表达载体pcDNAS/FRT中,获得三种重组质粒DlprME-pc5,D1JsprME-pc5,D1JsprM80E20JE-pc5.用脂质体法分别将重组质粒DNA转入293T细胞,通过免疫荧光、Western印迹检测外源基因在真核细胞中的分泌表达.结果 用免疫荧光法检测到分别转染了三种重组质粒的293T细胞的胞质中均有登革Ⅰ型病毒蛋白的表达.Western印迹检测转染了D1prME-pc5重组质粒的293T细胞上清中没有特异蛋白条带,转染了经基因改造的重组质粒D1JsprME-pc5和D1JsprM80E20JE-pc5的细胞上清中均存在登革Ⅰ型病毒的特异蛋白条带.结论 转染了三种重组质粒的293T细胞均可表达登革Ⅰ型病毒prM/E蛋白,只有在prM基因前添加了信号肽的重组质粒转染后蛋白才获得分泌表达.