人VIGILIN参与调控肝癌细胞H19和IGF2印记基因表达的研究

目的 探讨人高密度脂蛋白结合蛋白基因(VIGILIN)是否参与肝癌细胞在细胞周期中印记基因H19和胰岛素样生长因子2(IGF2)表达的调控.方法 通过流式细胞术检测人肝癌细胞HepG2细胞周期选择周期点,采用RT-PCR、RNA干扰、实时荧光定量RT-PCR检测各周期点VIGILIN、H19、IGF2基因表达.结果 ① HepG2细胞周期约为20 h;其中0～9 h、20～28 h约为S期,9～20 h、28～39 h约为G2/M、G1期,并选定6 h、20 h、43 h、60 h,分别代表S期中期、G1～S期、S期中期和G1期末; ②细胞周期同步化后加入血清,刺激VIGILIN转录,上调VIGILIN的表达,从G2/M至G1期,逐渐增加,G1期末达高峰,S期逐渐减少;与之相反,H19的表达,在S期逐渐增加,在G2/MG1期逐渐减少,在S期中期达到高峰.而IGF2的表达也增加但没有明显的周期性.H19与VIGILIN mRNA表达呈负相关(r=-0.6941,P<0.05).③用VIGILIN shRNA(pSIREN-VIG shRNA)重组载体转染HepG2细胞48 h后,相对于3个对照组(未转染组, 脂质体转染组和转染pSIREN-GFP shRNA组), 实验组VIGILIN mRNA的表达受到明显抑制,此时,IGF2 mRNA表达增加30.13%,H19 mRNA表达减少12.08%.结论 VIGILIN和H19 mRNA表达与细胞周期有关;VIGILIN参与调控H19、IGF2印记基因的表达.     

人CTCF N端融合蛋白的表达、抗体制备及鉴定

为研究CTCF的功能,进一步探索肿瘤的发病机制,我们成功制备了人转录因子CTCF N端融合蛋白多克隆抗体,并初步用于肿瘤细胞CTCF表达状态的分析。采用已构建的表达质粒PGEX-4T-2-CTCF-N,经IPTG诱导表达GST-CTCF N融合蛋白,亲和层析纯化GST-CTCF N融合蛋白,免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体。并通过Western blot,对肿瘤细胞和组织CTCF蛋白表达状态进行初步分析。本实验成功在大肠杆菌BL21中诱导表达了GST-CTCF N融合蛋白,经亲和层析纯化获得了纯化的融合蛋白。免疫新西兰大白兔获得了较高生物活性和特异性的多克隆抗体,Western blot证实此多克隆抗体能够特异性识别HepG2、HeLa、MCF-7癌细胞及组织的内源性CTCF蛋白,为今后从蛋白质水平研究CTCF基因表达调控研究打下了基础。     

肝癌患者E-cadherin基因启动子区CpG岛甲基化状态的研究

目的探讨抑癌基因E-cadherin基因启动子区CpG岛甲基化与人原发性肝癌(简称肝癌)发生、发展的关系,及其在肝癌早期诊断中的意义。方法用巢式甲基化特异性PCR对34例肝癌患者的癌组织、距离癌灶边缘>3 cm的远癌组织及10例未发生肝癌的肝硬变患者的肝硬变组织中E-cadherin基因启动子区CpG岛的甲基化状态进行检测。结果 E-cadherin基因启动子区CpG岛甲基化阳性率,在34例肝癌组织中为61.76%(21/34),明显高于远癌组织中的29.41%(10/34),P<0.05;在10例无肝癌的肝硬变组织中为50.00%(5/10),与肝癌组织和远癌组织比较差异均无统计学意义(P>0.05);在4例正常肝组织中均为甲基化阴性。联合检测癌组织E-cadherin基因CpG岛甲基化与血清甲胎蛋白两种分子标志物,肝癌的检出率可达82.35%。结论抑癌基因E-cadherin启动子区CpG岛甲基化可能在肝癌的发生、发展中起到重要作用,并且可能是早期事件,其在肝癌的临床诊断及治疗中的意义值得进一步深入研究。     

中药成分CDP对乳腺癌细胞P16,E-CADHERIN去甲基化作用的研究

目的 探讨中药成分CDP对乳腺癌细胞系T47D和MDA-MB-435的抑癌基因P16和E-CADHERIN启动子区CpG岛的去甲基化作用.方法 培养人乳腺癌细胞系 T47D和MDA-MB-435, 分别用不同剂量、同一剂量不同时间的CDP和5-azacytidine (5-aza-C) 处理细胞;用甲基化特异性PCR(MSP)和半定量RT-PCR,检测细胞中P16和E-CADHERIN基因的甲基化改变和RNA表达恢复情况.结果 ①在25、50、75和100 μmol/L剂量的CDP持续作用6 d后,T47D细胞P16基因启动子区CpG岛甲基化特异性条带减弱,在100 μmol/L剂量时消失,在4个剂量CDP作用下,非甲基化特异性条带均重新出现;在75和100 μmol/L浓度作用下时,T47D细胞中出现P16基因重新表达;②在50 μmol/L CDP作用144 h后,T47D P16基因启动子区CpG岛甲基化特异性条带仍存在;非甲基化特异性条带24 h出现并持续到144 h;在药物作用144 h时,P16出现表达.③在MDA-MB-435细胞中,用不同剂量CDP处理或同一剂量CDP处理不同时间后,均未观察到E-CADHERIN非甲基化条带的出现,RT-PCR也未检测到E-CADHERIN基因的表达. 结论在T47D细胞中,中药成分CDP可以剂量、时间依赖的形式逆转高甲基化的P16基因,而对MDA-MB-435细胞中高甲基化的E-CADHERIN基因无效,提示CDP药物存在靶分子反应多样性.