多肽:N-乙酰氨基半乳糖转移酶2的原核表达、纯化及酶活检测

目的：以人类多肽：N-乙酰氨基半乳糖转移酶2（ppGalNAc-12）为研究对象，利用载体pGEX-5X-3在大肠杆菌（E．Coli）BL21中原核表达其编码序列，并对表达产物进行纯化、复性及酶活检测。方法：首先利用PCR技术从克隆载体pDONR201-T2得到ppGalNAc-T2全长编码序列，将其亚克隆至原核表达载体pGEX-5X-3，形成重组表达质粒pGEX-5X-3／T2。重组质粒转化大肠杆菌DH5α，测序鉴定后转化BL21，异丙基硫代半乳糖（IPTG）诱导后，表达产物为主要以包涵体形式存在的融合蛋白。对其复性后用谷胱甘肽-琼脂糖（Glutathione-Sepharose）4B亲和层析柱进行纯化。然后根据ppGalNAc-T2的催化功能，设计底物，建立酶促反应体系，利用高效液相色谱（HPLC）进行酶活分析。结果：成功构建了原核表达重组载体pGEX-5X-3／T2，通过蛋白质电泳检测到分子量约为90 kD的融合蛋白的表达，利用亲和层析得到纯化的酶蛋白，并经Western印迹得以验证。反应后体系上柱洗脱后出现酶促反应的产物洗脱峰。结论：成功构建了重组表达载体pGEX-5X-3／T2，ppGalNAc-T2伞长编码序列被成功表达、纯化及复性，检测到具有酶活性。     

大鼠4-1BBLcDNA的克隆、分析及染色体定位

目的克隆、分析并染色体定位肿瘤坏死因子配体超家族（Tumor Necrosis Factor Superfamily，TNFSF）成员4-1BBL分子。方法在对小鼠、人4-1BBLmRNA进行生物信息学分析的基础上，采用PCR扩增、T载体克隆测序等实验技术，并用软件对基因进行了拼接、序列分析及同源性比较，同时通过荧光原位杂交（FISH）技术对该基因进行了染色体定位。结果首次获得了具有完整开放阅读框的大鼠eDNA，GenBank登录号为No．AY259541，通过同源性比较分析，证明该基因与小鼠高度同源，编码区的核苷酸序列与小鼠、人的同源性分别为88％、37％。推导出的大鼠4-1BBL蛋白质由308个氨基酸分子组成，分子量为33469d，胞外区有三个潜在的N糖基化位点：AA138，AA160和AA292，是典型的Ⅱ型糖蛋白，与小鼠、人在氨基酸水平的同源性分别为83％、31％，其中胞质区为76％、32％，跨膜区为45％、40％，胞外区为87％、28％。该基因定位于大鼠染色体9q1（Gen Bank UniGene登录号为No．Rn．46783）。结论大鼠4-1BBL胞内区的“SDAA”可能发挥着TNF家族中具有逆信号的其他成员的胞内区酪氨酸激酶Ⅰ磷酸化位点“SXXS”的作用。大鼠4-1BBLcDNA的成功克隆与定位为探讨4-1BBL在免疫共刺激中的作用机制以及TNF分子的进化研究打下了基础。     

共刺激分子B7-H3与糖基化相关性的初步探讨

目的：探讨共刺激分子B7-H3与N．乙酰氨基半乳糖转移酶之间的相关性。方法：采用RT-PCR的方法检测同一细胞系上B7-H3和N．乙酰氨基半乳糖转移酶（T1-T7）的表达，从而探讨它们之间可能的相关性。结果：成功地检测到了B7-H3与N．乙酰氨基半乳糖转移酶（T1-T7）表达的差异性和一致性。结论：共刺激分子B7-H3和N-乙酰氨基半乳糖转移酶（T1-T17）在T1、T2存在可能的结合点，为进一步的研究提供了线索。     

人类多肽:N-乙酰氨基半乳糖转移酶家族分子进化的初步研究

目的：探讨人类多肽：N-乙酰氨基半乳糖转移酶家族成员间的同源性，揭示其进化规律。方法：采用生物信息学软件和网上数据库对核酸蛋白质序列进行同源比较，结构域分析和进化树绘制。结果：人类多肽：N-乙酰氨基半乳糖转移酶家族一级结构、二级结构均有较高的同源性，系统进化树显示各成员来源于同一祖先并在不同时期分野。结论：各成员来自于同一祖先的同一家族，其进化方式属于趋异性进化。     

多肽:N-乙酰氨基半乳糖转移酶2酵母双杂交载体构建及激活检测

目的：为探讨O-糖基化在肿瘤发生发展及转移中的作用,构建pGADT7／ppGalNAc—T2载体,并转化酵母AH109进行激活检测。方法：采用PCR技术从pDONR201-T2得到ppGalNAc-T2全长编码序列,亚克隆至酵母双杂交载体pGADT7,醋酸锂法转染酵母AH109,并进行激活检测。结果：酶切图谱分析和基因测序证实pGADT7／ppGal—NAc-T2载体构建成功。并转化酵母AH109,激活检测呈阴性。结论：成功构建了pGADT7／ppGalNAc—T2载体,并进行了激活检测,为进一步研究ppGalNAc-T2的功能奠定了基础。     

全反式维甲酸对HL60细胞株三种糖基转移酶家族表达的影响

目的从mRNA水平检测HL60细胞株中多肽:N-乙酰氨基半乳糖转移酶家族(polypeptide:Nacetylgalactosaminytra -nsferases,ppGalNAcTs)、N-乙酰氨基葡萄糖基转移酶家族(UDP-N-acetylglucosamine:beta-galactose betal, 3-N-acetylglucosaminyltransferases,β3GnTs)及O-连接乙酰氨基葡萄糖转移酶家族(O-linked GlcNAc transferase,OGnT)的表达情况,研究全反式维甲酸(All-transretinoic acid,ATRA)培养对不同糖基转移酶表达水平的影响。方法采用Real time RT- PCR方法从mRNA水平上研究ppGalNAcTs、β3GnTs、OGnT的表达以及加入ATRA后表达水平的变化,用3H掺入试验检测加入ATRA对细胞增殖的影响,流式细胞仪观察细胞周期情况,激光共聚焦显微镜观察细胞形态的变化。结果加入ATRA 后HL60细胞株中β3GnT1、ppGalNAcT2表达量急剧增加,细胞阻滞在G2／M期,细胞的生长增殖受到抑制,细胞向粒系分化。结论加入分化诱导剂后细胞发生显著变化,提示β3GnT1、ppGalNAcT2与白血病细胞株的分化可能有一定关系。