携RGDS超声造影剂的制备及体外靶向血栓研究

目的探讨制备携精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸-丝氨酸(Arg-Gly-Asp-Ser,RGDS)靶向脂膜超声造影剂的制备,并对靶向微泡的特性及靶向作用进行初步鉴定.方法分别采用酰胺键共价键合的方式和表面吸附法将脂膜超声造影剂与RGDS血栓靶向短肽片段进行结合;制备产物通过流式细胞仪进行携带率和稳定性的检测;对内源性凝血途径产生的血栓进行寻靶作用研究.结果流式细胞仪显示共价键合RGDS脂膜超声造影剂其微泡外壳波长发生了明显变化,显示改变率达到82%,而表面吸附法制备的靶向超声造影剂改变率达到23%;激光共聚焦显微镜显示携带RGDS的脂膜超声造影剂在大量的PBS液清洗后,对离体血栓仍具有很强的靶向性和稳定性,而表面吸附法制备的靶向超声造影剂在大量PBS液清洗后,失去了其靶向性.结论采用共价键合的化学修饰方法可以成功制备稳定性好的亲血栓靶向脂膜超声造影剂.     

血栓靶向脂膜超声造影剂的制备与初步评价

目的制备血栓靶向脂膜超声造影剂,并对其配体结合率进行初步评价。方法通过生物素-抗生物素蛋白桥连法,制备携带血栓靶向配体的脂膜超声造影剂,非靶向脂膜微泡为对照;采用流式细胞仪初步评价靶向微泡配体结合率及其影响因素。结果靶向微泡荧光检测为阳性,对照组为阴性;流式细胞仪分析结果显示该血栓靶向微泡配体结合率达82.96%,对照组仅为0.92%、0.89%。结论采用生物素-抗生物素蛋白桥连接法,可以成功制备血栓靶向脂膜超声造影剂。微泡纯化过程中离心速度与离心时间对配体结合率的影响具有显著意义。     

靶向超声造影剂制备的方法学研究

靶向超声造影是目前超声造影的前沿性课题，随着超声造影剂在临床的不断应用与实践，使得超声诊断学与治疗学发生了跳跃式的前进。靶向超声造影技术通过靶向作用于生物分子组成成分来突出显示病变组织的病变部位，从而提高影像诊断的准确性与敏感性，因此靶向超声造影剂成为现今研究领域的热点。然而，要想设计生产靶向超声造影剂能够按照预定的靶向至病变部位，且能流经循环系统后依然保持其特有的稳定性，故要求研究靶向超声造影剂的学者不断在基础研究与方法学上改进。现就靶向超声造影剂的方法学方面作一综述。     

携RGDS的脂膜氟烷超声造影剂增强血栓显影的实验研究

目的探讨携RGDS的脂膜超声造影剂对体外血栓的显影效果。方法健康人体新鲜血块10块,大小2cm×1cm×1cm,以蠕动泵为循环动力,以4％琥珀酰明胶注射液为循环液,输液器为材料建立一密闭式体外循环系统,模拟人体体循环,血块置于容器内,观察携RGDS的脂膜超声造影剂和非靶向脂膜超声造影剂对血栓的显像效果。结果模拟体循环时间30s,二维超声显示,非靶向超声造影剂组血栓表面线状回声增强,内部无增强;靶向超声造影剂组血栓表面回声增强,内部回声显著增强;超声检测后行冰冻切片显微镜观察,非靶向造影剂组100倍下观察,血栓切片边缘有少量微泡黏附,400倍下,可见血栓纵隔缝隙内少量微泡存在;靶向组100倍下即可见到密集的微泡分布,400倍下血栓纵隔缝隙内密集线状分布的微泡。结论携RGDS的脂膜超声造影剂可显著增强新鲜血栓超声显像。     

超声介导携RGDS靶向超声造影剂对体外血栓的助溶研究

目的探讨携RGDS的脂膜氟烷超声造影剂（亲血栓靶向超声造影剂）对体外血栓的助溶效果。方法健康人体新鲜静脉血块60份，分为3组，分别加入亲血栓靶向超声造影剂、非靶向超声造影剂和生理盐水进行超声消融；采用超声治疗仪，选择1．2W／cm^2，距离3cm，治疗时间15min。称量溶栓前后血块的质量，组间比较采用t检验。电镜扫描经消融后的血块表面结构。结果经超声介导造影剂助溶前后的血块质量组间比较差异均有统计学意义（P〈0．01）。电镜扫描显示，生理盐水组血块经消融后表面结构无明显改变，靶向超声造影剂组可见大量均匀分布的空洞和裂隙，非靶向超声造影剂组仅见少量分布的小型凹陷及微小裂隙。结论治疗超声介导下的超声造影剂具有助溶作用，血栓靶向超声造影剂较非靶向超声造影剂具有更强的助溶效果。     

体外血脑屏障模型的建立与鉴定

目的应用原代分离培养BALB／c小鼠脑微血管内皮细胞（brain microvascular endothelial cells，BMVEC）建立体外血脑屏障模型，探讨跨血脑屏障（blood brain barrier，BBB）电阻与屏障渗透功能的动态关系以及最佳构建条件。方法用酶消化、机械分离结合密度离心的方法得到原代BALB／c小鼠脑血管内皮细胞，通过培养在具有特殊质材和孔径的Transwell小室上建立BBB体外实验模型，采用倒置显微镜、电镜观察细胞形态结构和生长规律，紧密连接ZO-1蛋白免疫组化检测，比较血脑屏障形成前后膜两侧电阻动态变化与1H葡萄糖通透性的关系等方法，探讨血脑屏障模型的建立及生长特性。结果BMVEC培养至汇合后具有典型的“铺路石”样外观；扫描电镜显示细胞形成致密单层，透射电镜、ZO-1蛋白免疫组化证实细胞问形成光滑、连续、高密度的紧密连接；1H葡萄糖的通透量与实时电阻呈负相关，内皮细胞电阻随着通透性的增加而降低，通透率最低时跨细胞电阻为（346±10）Ω／cm2。结论建立的BBB体外模型在形态学、电阻和通透性方面具备了BBB的基本特性。     

携RGDS的靶向超声造影剂的制备及鉴定

目的制备血栓靶向脂膜超声造影剂,并对其理化特性及靶向作用进行鉴定.方法将脂膜超声造影剂通过酰胺键共价键键合的方式与血栓靶向短肽片段(RGDS)进行结合.制备产物通过流式细胞仪进行携带率和稳定性的检测;对内源性凝血途径产生的血栓进行寻靶特性研究.结果流式细胞仪显示携带RGDS的脂膜超声造影剂其波长发生了明显变化,携带率达到82%;激光共聚焦显微镜显示携带RGDS的脂膜超声造影剂对离体血栓具有很强的靶向性和稳定性.结论采用共价键键合的化学修饰方法成功制备了亲血栓靶向脂膜超声造影剂.     

诊断超声联合微泡开放体外血脑屏障的机理研究

目的 建立体外血脑屏障(blood brain barrier,BBB) 模型,探讨诊断超声联合造影剂(微泡)可逆性开放血脑屏障的机理.方法 BALB/c小鼠脑微血管内皮细胞(brain microvascular endothelial cells,BMVEC) 建立BBB体外实验模型.选择青壮年标本颞骨片,大小1.5 cm×2.0 cm,置于细胞小室上,模拟经颅骨超声声窗条件,根据分组在模型中加入自制的脂膜氟烷超声造影剂(微泡),采用经头颅超声诊断仪辐照,辐照10 min.分为4组,每组4个样本:(1)对照组;(2)超声组;(3)微泡组;(4)超声联合微泡组.经上述处理后,光镜和电镜观察BBB细胞膜及超微结构改变,在不同的时间点检测跨内皮细胞电阻(transendothelial electrical resistance,TEER)和辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase,HRP) 的通透性,探讨可逆开放BBB的机理.结果 光镜和扫描电镜显示实验后4组样本细胞表面无明显形态学改变和损伤,透射电镜证实超声联合微泡组辐照后细胞间紧密连接向桥粒连接过渡,超声组紧密连接减少,但没有明显连接分离现象; HRP通透率检测显示超声联合微泡组辐照后细胞通透率呈波浪形增加,18 h后完全恢复,超声组辐照后BBB通透率增加,于30 min内恢复,通透率最高时跨细胞电阻抗(TEER)降低至(179±8) Ω/cm2,随着HRP通透率的减低,TEER逐渐恢复;电镜、HRP通透率在微泡组和对照组没有明显改变.结论 微泡联合诊断超声波能通过短暂开放紧密连接,降低细胞间电阻,提高通透率,达到可逆性开放血脑屏障.     

诊断超声联合微泡促顺铂跨血脑屏障转运的实验研究

目的 探讨诊断超声联合超声造影剂(微泡)促顺铂跨体外血脑屏障(BBB)模型的可行性.方法 利用BALB/c小鼠脑微血管内皮细胞(BMVEC)建立BBB体外实验模型,根据是否加入微泡和超声辐照,分为四组:对照组、超声组、微泡组和超声联合微泡组.每组添加浓度为5 ng/μl的生物素胶体金50 μl和顺铂,顺铂达到9 μg/cm2,供池定容在460 μl,分别于超声辐照后再培养48 h,并在培养不同时间点从受池中取样,通过高效液相色谱法(HPLC)检测顺铂的通透率;透射电镜观察细胞膜与细胞内超微结构的变化以及胶体金的分布;实验前后细胞小室行扫描电镜能谱分析.结果 2 MHz、0.6 W/cm2、10 min的诊断超声辐照联合脂膜微泡(1 μl/ml)能够促顺铂跨体外BBB模型的转运,透射电镜观察到内皮细胞胞饮小体增多,细胞内可见胶体金分布;单纯超声辐照组细胞间隙可见少量胶体金分布,对照组和微泡组细胞内外均不能见到胶体金;扫描电镜能谱分析,各组碳和锌元素总量均无改变,而超声组和超声联合微泡组两种元素的能谱分布发生转变.经HPLC检测,顺铂通透量超声组与超声联合微泡组显著高于对照组与微泡组,组间比较差异有统计学意义.结论 微泡联合诊断超声波能通过短暂开放紧密连接,促进药物顺铂跨BBB的转运.