实时荧光定量RT-PCR监测恒河猴体内人/猴免疫缺陷病毒载量在传代过程中的变化

目的为分析中国SHIV/猕猴AIDS模型的病毒载量变化趋势,建立一种实时、灵敏、特异的针对人/猴免疫缺陷病毒的定量检测方法。方法体外转录制备RNA标准品,利用TaqManEZRT-PCR试剂盒的反应体系和针对SHIVgag保守区91个碱基的TaqMan探针和引物,建立一步法实时荧光定量RT-PCR。提取126份来自SHIV-CN97001感染恒河猴血浆病毒RNA并定量检测。结果利用梯度稀释的RNA标准品对反应体系进行优化,标准曲线下限达到2×102拷贝/ml,相关性(r>0.99)及重复性(CV=4.14%)均能达到测定要求。病毒载量的检测结果表明SHIV-CN97001在猴体内传代过程中病毒载量有先升后降的趋势,病毒载量通常在接种病毒或感染猴的全血后第14天达到高峰。血浆载量可达到105~106拷贝/ml。结论成功地建立了一步法定量SHIVRNA的实时荧光定量RT-PCR,为SHIV/恒河猴AIDS模型的建立与应用提供了灵敏的病毒载量检测方法。SHIV-CN97001的体内繁殖能力在猴体内传代过程中有所增强。     

中国恒河猴(Macaca mulatta)外周血CD4+CD25+T淋巴细胞的研究

目的:研究中国恒河猴外周血中CD4 CD25 T淋巴细胞亚群及其分布频率。方法:利用流式细胞术对50只中国恒河猴外周血CD4 CD25 T淋巴细胞进行了分析。结果:发现所有被检测的恒河猴个体中均存在明显的CD4 CD25 T淋巴细胞亚群;CD4 CD25 T淋巴细胞大约占CD4 T淋巴细胞的9.1%(变化范围为2.6%～18.1%);其中CD4 CD25highT淋巴细胞约占2.5%(0.3%～5.5%)。对不同年龄和性别个体中CD4 CD25 T淋巴细胞频率的初步分析未发现统计学上有年龄或性别差异。结论:中国恒河猴可用于与CD4 CD25 T细胞相关的人类疾病的研究中。     

SHIV-XJ02170感染恒河猴后期的传代特点和env基因变异

目的研究SHIV-XJ02170在中国恒河猴感染后期传代过程中病毒和宿主的变化特点,并分析env基因的序列变异。方法将感染中国恒河猴G0401V后期(5年)的SHIV-XJ02170病毒垂直传代2只猴(G0401V→G0402V→0403V),同时,剔除G0401V猴CD8+T细胞使潜伏的病毒大量复制后传代1只猴(G0401V→G0404V),应用流式细胞术、病毒载量测定、序列分析等方法研究该病毒在猴体内长期适应后的病毒和免疫学指标及序列变异特点。结果 G0401V在感染后期仍能稳定传代,且表现出毒力增强的特点。其传代猴G0402V在传代后41 d死亡,外周血CD4+T淋巴细胞衰竭,仅为43个/mL,符合艾滋病感染猴快速进展型的特征。剔除体内CD8+T细胞之后的传代猴G0404V的表现类似G0401V,即长期低水平的病毒血症水平。env基因序列分析发现SHIV-XJ02170在G0401V体内长期适应后发生了可遗传的序列变异,并引起糖基化位点的改变。结论 SHIV-XJ02170在猴体长期适应后的传代过程中表现出向强毒株过渡的特征,为进行SHIV-XJ02170感染性克隆的构建奠定了良好的实验基础。     

云南地区恒河猴MHC部分基因频率及多态性的分析

目的 不同种群恒河猴(Macaca mulatta)主要组织相容性复合体(major histocompatibility complex,MHC)基因的差异性,很大程度上影响了用其作为动物模型的实验研究结果的稳定性、可靠性和可重复性.清晰了解云南地区恒河猴种群免疫遗传学背景对于运用该种群开展各项研究非常重要.恒河猴基因Mamu(Macaea mulaua)-A*01就被公认与猴免疫缺陷病毒(SIV)的感染与延缓病程相联系.Mamu-Ⅱ类等位基因Marnu-DRB1*0306、0309有研究表明也与SIV感染后的病程发展有关.方法 针对目前研究热点的Mamu-A*01基因及Ⅱ类Mamu-DRB1*0306、0309基因,采用序列特异性引物-聚合酶链式反应方法(PCR-SSP),对云南地区的140只恒河猴(其中92只来源于云南景东野外自然繁殖群、48只来源于本灵长类中心自繁群)进行检测.并对阳性样本用部分测序结合单链构象多态性分析(SSCP)的方法加以验汪.结果 Mamu-A*01检测结果为阴性.Mamu-DRB1*0306、0309基因频率分别为32%及45%.结论 初步显示云南地区恒河猴种群Mamu-A*01基因可能缺失或基因频率很低,但存在Mamu-DRB1*0306、0309基因.初步证明SSCP方法代替大规模测序是可行的,为云南地区恒河猴在AIDS研究中的应用提供了部分依据,一定程度上填补了该种群的遗传背景资料.     

中国恒河猴Mamu-A*01基因筛查及其对抗原肽p11C的特异性CTL反应

目的 筛查中国恒河猴Mamu-A*01基因,比较中国恒河猴和印度恒河猴的Mamu-A*01基因序列和功能是否相同.方法 PCR方法检测128只中国恒河猴,用特异性引物扩增Mamu-A*01基因,将PCR扩增后的产物克隆测序后与印度恒河猴的Mamu-A*01基因进行同源比对;酶联免疫斑点检测 (ELISPOT) 方法分别检测5只Mamu-A*01基因阳性和5只阴性恒河猴针对SIV、SHIV抗原肽p11C的特异性CTL反应.结果 共筛查出5 只Mamu-A*01基因阳性恒河猴 (3.91%),经测序分析后与印度恒河猴的同源性可达99.1 %.这5只均为SIV/SHIV感染恒河猴,其中四只SIV感染的猴的ELISPOT结果显示针对p11C的高频CTL反应,斑点数在500-1400/106 PBMCs之间,而另1只SHIV感染的恒河猴及5只阴性猴没有斑点出现.结论 中国恒河猴含有Mamu-A*01基因,基因频率有区域性差异,中国恒河猴的Mamu-A*01可提呈特异性抗原肽p11C.     

人类免疫缺陷病毒的传播途径及影响因素

在30多年前美国首次报道了同性恋人群中发现的获得性免疫缺陷综合症(acquired immunodeficiency syndromes, AIDS),其流行特征表明AIDS通过性接触、母婴和血液三种方式传播. AIDS的病原体为人免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus, HIV),主要为HIV-1. HIV-1几乎不能突破结构和功能完整的皮肤,主要由黏膜(包括结构和功能完整的黏膜)侵入人体.因此,黏膜是HIV-1的自然传播途径.与HIV-1传播有关的黏膜包括消化道黏膜和泌尿生殖道黏膜.黏膜传播风险存在显著的部位和个体差异,黏膜结构和功能的完整性、黏膜中靶细胞的丰度、机体免疫状态、黏膜表面共生微生物及宿主遗传背景等都与黏膜传播有关.许多因素与黏膜屏障功能密切相关,关于它们在HIV-1入侵中的作用的研究将促进HIV-1黏膜传播的预防和控制.     

中国恒河猴DNGR-1分子C型凝集素样结构域在大肠杆菌系统表达

目的获得恒河猴C型凝集素结构域家族9的A成员(Clec9A)基因编码区序列;体外表达CLEC9A的C型凝集素样结构域(CTLD)。方法利用Clec9A基因特异引物,反转录PCR扩增中国恒河猴Clec9A基因编码区,亚克隆至pGEM-T载体,获得pGEM-T-DNGR质粒并进行测序。构建CLEC9A分子的CTLD区原核表达质粒pET-32a-CTLD,转化BL21(DE3),IPTG诱导重组蛋白表达,并用SDS-PAGE和Western blot法对目的蛋白进行鉴定。结果 PCR扩增得到726 bp的Clec9A编码区全长,测序和序列比对发现恒河猴CLEC9A编码区的核苷酸序列与人和小鼠的同源性分别为95.0%和73.1%,推测的氨基酸同源性分别为91.7%和57.3%。体外表达获得相对分子质量(Mr)约32 000的CTLD融合蛋白,Western blot方法鉴定发现其与人DNGR-1分子具有相似的抗原性。结论中国恒河猴Clec9A基因与人的高度相似并能编码与人CTLD抗原性相似的蛋白。     

粘膜免疫与艾滋病的预防和控制

粘膜是大多数病原微生物侵入机体的门户。粘膜免疫系统的特异和天然免疫机制阻止了绝大部分粘膜感染的发生。世界范围内约有90%的人类免疫缺陷病毒(HIV)感染是通过粘膜发生的。与HIV-1粘膜传播有关的粘膜包括泌尿生殖系统和消化系统粘膜。消化道粘膜不仅在HIV-1侵入机体的过程中作为病毒入侵的门户,而且在HIV-1感染后为病毒的繁殖提供场所。HIV-1感染导致粘膜中CD4 T淋巴细胞不断减少,可能在HIV-1感染后的病理过程中发挥重要作用。通过杀微生物制品或艾滋病疫苗阻断或限制HIV-1跨越粘膜屏障,可能是控制HIV/AIDS粘膜传播的最有效的生物学干预措施。     

SHIV-KB9感染中国恒河猴的实验研究

目的研究SHIV-KB9感染中国恒河猴的可能性,确定其有效病毒浓度,明确实验猴感染SHIV-KB9后的病毒复制和免疫反应情况,建立SHIV/SAIDS模型,并确定、完善SHIV/SAIDS模型评价指标。方法实验前采集猴血清并进行血清学检查。选出6只无SIV、STLV、SRV/D和B病毒感染的恒河猴,分别用10倍系列稀释的病毒液静脉感染实验猴,使用流式细胞术、血常规检测、病毒分离、DNA-PCR和RT-PCR等方法确定实验猴是否被感染,以及感染后恒河猴体内病毒复制和免疫细胞损伤情况,持续测定3个月。结果实验猴的血浆病毒载量、病毒分离结果、CD4+/CD8+比值和CD4+细胞数等证实,4.8×106copies/mL以上浓度的SHIV-KB9病毒液能成功感染中国恒河猴。结论SHIV-KB9成功感染中国恒河猴为进一步建立SHIV/SAIDS模型奠定了良好的实验基础,为使用此模型评价抗病毒药物或疫苗提供了条件。