人类α-actin 启动子真核表达载体的构建

目的 利用PCR技术克隆了人类α-actin 基因的启动子(约450 bp).方法 将PCR产物连接到pMD-18T载体上,酶切鉴定后测序,并进行软件分析.结果与结论 序列分析表明,扩增片段虽然与GenBank里登陆的序列同源性仅为72%,但包含有完整的启动子元件和转录专一调节因子相应的识别序列.用去掉启动子的pEGFP-N1作为框架结构,尝试构建真核表达载体,并获得了含人类心肌α-actin启动子的真核表达载体pEGFP-N1-α-actin-P.     

绿色荧光蛋白在胚胎干细胞研究中的应用

绿色荧光蛋白(green fluorescent protein．GFP)作为一种方便、有效的活性标记物，无需外源反应底物，无需进行细胞或组织的固定和渗透处理．使检测更加方便。是细胞生物学和分子生物学研究的一个重要工具，已得到了广泛的应用。胚胎干细胞(Embryonic StemCell．ES cell)是从早期胚胎中分离得到的多能细胞，在胚胎发育、细胞移植、组织器官构建、药物研制、基因治疗等研究方面发挥着巨大的作用。本文就GFP的特性及其在ES细胞研究中的应用作一简述。     

胚胎干细胞生物学特性

来源于早期胚胎或原始生殖细胞的胚胎干细胞(ES细胞)可在体外抑制分化培养条件下无限扩增,并保持未分化状态和多能性.ES细胞研究是国际生物科学的热点课题之一.多年来,众多学者对ES细胞形态结构、核型、分化潜能、碱性磷酸酶、胚胎阶段特异性细胞表面抗原的表达以及一些分子标记等生物学特性作了大量研究报道,为ES细胞分离鉴定提供了理论基础.     

人胎肺间充质干细胞分离培养条件及向心肌细胞诱导分化的可能关联

目的:观察分离培养得到人胎肺间充质干细胞的条件,并分析诱导其转分化为心肌细胞的可能性及其相关因素。方法:实验于2003-01/2005-12在西北农林科技大学陕西省干细胞工程技术研究中心完成。取10周龄人工流产胎儿肺组织,0.25%胰蛋白酶消化,经培养得到人胎肺间充质干细胞。观察细胞形态及增殖,测细胞生长曲线。将人胎肺间充质干细胞以1.8×104/孔接种于明胶预处理的24孔板中。加Dulbecco修正Eagle’s基础培养液培养24h后弃去培养液,磷酸盐缓冲液(-)洗两三次。每14孔为1组,分别加入Dulbecco修正Eagle’s基础培养液和先进的Dulbecco修正Eagle’s(分别添加2%、5%、8%和10%新生牛血清)5种不同的培养液,其后方法同上,每天选任意两孔计数,求平均值。用流式细胞仪对所分离第8代细胞进行以下细胞表面标志检测:CD45、CD11a、CD14、CD90、CD34、CD71、CD25、CD105、CD117、CD166和CD44。人胎肺间充质干细胞向心肌细胞诱导分化:将第12代人胎肺间充质干细胞以500个/孔接种于明胶预处理的24孔板中。每6孔为1组,分别在Dulbecco修正Eagle’s基础培养液中添加0、5、10、20μmol/L5-氮胞苷,每组中每2孔为一诱导时间段,分别诱导培养24,48,72h后换成Dulbecco修正Eagle’s基础培养液,以后每3d换液1次。观察细胞在各组中变化情况,诱导12d后固定进行糖元染色和α平滑肌肌动蛋白免疫组化染色。结果:成功分离了人胎肺间充质干细胞,细胞已扩增至26代,流式细胞仪检测CD25、CD105、CD166和CD44表达阳性;CD71(39.1%)和CD117(29.8%)弱阳性。Dulbecco修正Eagle’s培养液比先进的Dulbecco修正Eagle’s培养液更适合于这类细胞生长。经10μmol/L5-氮胞苷诱导48h后,糖元染色、心肌α平滑肌肌动蛋白免疫组化染色阳性细胞率达60%以上。结论:①人胎肺间充质干细胞在Dulbecco修正Eagle’s基础培养液中能够大量扩增。②并表达CD25,CD105,CD166和CD44等细胞表面标志。③10μmol/L5-氮胞苷诱导48h对该细胞向心肌细胞分化有明显促进作用。