肾疏宁干预HBV诱导的HK-2细胞转分化及迁徙能力的研究

[目的]探讨肾疏宁对乙型肝炎病毒(HBV)质粒诱导HK-2细胞发生转分化的干预作用。[方法]制备小鼠含药血清;培养HK-2细胞并进行HBV质粒转染。将细胞分为:空白血清对照组、空质粒组、HBV组、肾疏宁低浓度组、肾疏宁中浓度组、肾疏宁高浓度组。运用酶联免疫吸附实验(ELISA)、免疫细胞化学法和Transwell细胞体外迁徙实验检测HK-2细胞中乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)、乙肝病毒e抗原(HBeAg)、α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、E-钙黏蛋白(E-cadherin)的表达以及细胞迁徙能力。[结果] ELISA检测:HBV组与空质粒组和空白血清组比较,HBsAg、HBeAg表达上调,差异有统计学意义(P0.01)。免疫细胞化学检测:与HBV组比较,肾疏宁低浓度组、肾疏宁中浓度组、肾疏宁高浓度组α-SMA蛋白表达明显下调,差异有统计学意义(P0.01)。与HBV组比较,肾疏宁低浓度组、肾疏宁中浓度组、肾疏宁高浓度组有上调E-cadherin蛋白表达的趋势,但差异无统计学意义(P0.05)。与HBV组比较,肾疏宁低浓度组、肾疏宁中浓度组、肾疏宁高浓度组细胞迁徙能力明显减弱,差异有统计学意义(P0.01)。[结论] HBV转染HK-2细胞会造成细胞转分化并增强细胞迁徙能力。而肾疏宁含药血清可以减轻由HBV导致的上皮细胞转分化并减弱其细胞迁徙能力。     

糖肾方含药血清对高糖诱导肾小管上皮细胞增殖作用及对TGF-β1、HO-1干预作用的研究

[目的]探讨糖肾方含药血清对高糖诱导肾小管上皮细胞增殖作用及对转化生长因子(TGF)-β1、α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、血红素氯合酶-1(HO-1)干预作用。[方法]制备小鼠含药血清;培养肾小管上皮细胞分为:空白对照组、高糖组(30 mmol/L葡萄糖)、空白血清组(30 mmol/L葡萄糖+10%空白血清)、糖肾方低剂量血清组(30 mmol/L葡萄糖+10%低剂量含药血清)、糖肾方高剂量血清组(30 mmol/L葡萄糖+10%高剂量含药血清)。使用4-甲基偶氮唑蓝(MTT)法检测糖肾方含药血清对高糖诱导肾小管上皮细胞增殖的影响。运用逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)和蛋白免疫印迹法(Western blotting)检测肾小管上皮细胞中TGF-β1、HO-1和α-SMA蛋白的表达。[结果]高糖诱导下,肾小管上皮细胞呈成纤维细胞样的长梭形,细胞核呈梭形改变。MTT检测:与空白组比较,高糖组光度值明显增高(P0.05);与高糖组比较,高低剂量含药血清组在培养24 h后吸光度值均有下降,吸光度差异有统计学意义(P0.05),且高剂量组光度值下降强于低剂量组(P0.05)。Western blotting及RT-PCR测定实验结果显示:与空白对照组细胞对比,高糖组中TGF-β1、α-SMA含量增加;经过含药血清干预后,高糖诱导的HK-2细胞TGF-β1、α-SMA含量降低,差别有统计学意义(P0.05);糖肾方高、低剂量组血清比较,在降低TGF-β1方面,高剂量组效果较好(P0.05),在降低α-SMA方面没有统计学差异(P0.05)。HO-1在高糖诱导后含量稍升高,与空白对照组对比,差异有统计学意义(P0.05);在经过糖肾方含药血清干预后,含量升高,与高糖组对比,差异有统计学意义(P0.05),糖肾方高低剂量组血清比较,升高HO-1含量方面没有统计学差异(P0.05)。[结论]糖肾方通过抑制高糖诱导的肾小管上皮细胞增殖和干预TGF-β1、α-SMA、HO-1相关分子的表达,可以抑制细胞外基质成分沉积,减少氧化应激反应,减轻细胞损伤,逆转上皮-间质转分化,从而抑制肾间质纤维化,延缓糖尿病肾病病情进展。     

糖肾1号方含药血清对高糖环境下培养的HK-2细胞中TGF-β1、α-SMA、FN mRNA和蛋白水平的影响

[目的]观察糖肾1号方含药血清干预高糖环境下培养的人肾小管上皮细胞（HK-2）中转化生长因子-β1（TGF-β1）、α-平滑肌蛋白（α-SMA）、纤维连接蛋白（FN）mRNA和蛋白水平,初步探索糖肾1号方治疗糖尿病肾病可能的作用机制。[方法]选用HK-2细胞,分为空白组、高糖组、空白血清组、糖肾1号方含药血清低剂量组、糖肾1号方含药血清高剂量组。高糖环境下培养24 h后,进行血清干预24 h,培养48 h后收集细胞,通过逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）和蛋白免疫印迹（Western Blot）法检测HK-2细胞中TGF-β1、α-SMA、FN mRNA和蛋白表达水平。[结果]1）与空白组相比,高糖组的TGF-β1、α-SMA、FN mRNA和蛋白表达水平明显增多,差异具有统计学意义（P<0.05）。2）与高糖组相比,糖肾1号方低剂量组、糖肾1号方高剂量组TGF-β1、α-SMA、FN mRNA表达水平减少,差异具有统计学意义（P<0.05）。3）与高糖组相比,糖肾1号方低剂量组FN蛋白表达水平减少,差异具有统计学意义（P<0.05）,糖肾1号方高剂量组α-SMA、FN蛋白表达水平减少,差异具有统计学意义（P<0.05）。4）与糖肾1号方低剂量组相比,糖肾1号方高剂量组TGF-β1、FN mRNA降低,差异具有统计学意义（P<0.05）。[结论]糖肾1号方含药血清可抑制TGF-β1、α-SMA、FN mRNA和α-SMA、FN蛋白表达水平,糖肾1号方高剂量组效果优于糖肾1号方低剂量组。     

糖肾方含药血清对高糖诱导肾小管上皮细胞增殖作用及对TGF-β1、HO-1干预作用的研究

[目的]探讨糖肾方含药血清对高糖诱导肾小管上皮细胞增殖作用及对转化生长因子（TGF）-β1、α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）、血红素氯合酶-1（HO-1）干预作用。[方法]制备小鼠含药血清;培养肾小管上皮细胞分为：空白对照组、高糖组（30 mmol/L葡萄糖）、空白血清组（30 mmol/L葡萄糖+10%空白血清）、糖肾方低剂量血清组（30 mmol/L葡萄糖+10%低剂量含药血清）、糖肾方高剂量血清组（30 mmol/L葡萄糖+10%高剂量含药血清）。使用4-甲基偶氮唑蓝（MTT）法检测糖肾方含药血清对高糖诱导肾小管上皮细胞增殖的影响。运用逆转录聚合酶链式反应（RT-PCR）和蛋白免疫印迹法（Western blotting）检测肾小管上皮细胞中TGF-β1、HO-1和α-SMA蛋白的表达。[结果]高糖诱导下,肾小管上皮细胞呈成纤维细胞样的长梭形,细胞核呈梭形改变。MTT检测：与空白组比较,高糖组光度值明显增高（P<0.05）;与高糖组比较,高低剂量含药血清组在培养24 h后吸光度值均有下降,吸光度差异有统计学意义（P<0.05）,且高剂量组光度值下降强于低剂量组（P<0.05）。Western blotting及RT-PCR测定实验结果显示：与空白对照组细胞对比,高糖组中TGF-β1、α-SMA含量增加;经过含药血清干预后,高糖诱导的HK-2细胞TGF-β1、α-SMA含量降低,差别有统计学意义（P<0.05）;糖肾方高、低剂量组血清比较,在降低TGF-β1方面,高剂量组效果较好（P<0.05）,在降低α-SMA方面没有统计学差异（P>0.05）。HO-1在高糖诱导后含量稍升高,与空白对照组对比,差异有统计学意义（P<0.05）;在经过糖肾方含药血清干预后,含量升高,与高糖组对比,差异有统计学意义（P<0.05）,糖肾方高低剂量组血清比较,升高HO-1含量方面没有统计学差异（P>0.05）。[结论]糖肾方通过抑制高糖诱导的肾小管上皮细胞增殖和干预TGF-β1、α-SMA、HO-1相关分子的表达,可以抑制细胞外基质成分沉积,减少氧化应激反应,减轻细胞损伤,逆转上皮-间质转分化,从而抑制肾间质纤维化,延缓糖尿病肾病病情进展。     

肾疏宁对HBV诱导人肾小管上皮细胞转分化的影响

目的探讨肾疏宁干预乙型肝炎病毒(HBV)诱导人肾小管上皮细胞(HK-2)转分化,延缓肾间质纤维化作用的可能机制。方法通过75只C57BL/6小鼠的中药肾疏宁灌胃,制备含药血清;使用Lipofectamine转染HBV至HK-2的方法造模;将细胞分为:空白血清对照组、空质粒组、HBV组、贝那普利组、肾疏宁低浓度组、肾疏宁中浓度组、肾疏宁高浓度组。运用酶联免疫吸附实验(ELISA)、实时荧光定量PCR法、蛋白质印迹(Western blot)法检测HK-2细胞中HBsAg、HBeAg、TGF-β1、p-Smad2、p-Smad3、Smad7、Col-Ⅲ、ColⅣ、FN的表达。结果 ELISA检测结果:HBV组与空质粒组比较,HBsAg、HBeAg、TGF-β1表达上调(P0.01);与HBV组比较,贝那普利组、肾疏宁低浓度组、肾疏宁中浓度组、肾疏宁高浓度组TGF-β1蛋白表达下降(P0.001);与贝那普利组比较,肾疏宁低浓度组TGF-β1的表达相对较高(P0.05)。实时荧光定量PCR检测结果:与HBV组比较,贝那普利组、肾疏宁各干预组ColⅢ、Col-Ⅳ、FN mRNA表达明显下降(P0.001)。Western blot检测结果:与HBV组比较,贝那普利组、肾疏宁各干预组p-Smad2、p-Smad3蛋白表达明显下降(P0.001)。结论肾疏宁可通过干预TGF-β1/Smad信号通路减轻HBV诱导的人肾小管上皮细胞转分化,并减轻细胞外基质的沉积,从而延缓纤维化的进程。     

“黄芪-丹参”对单侧输尿管梗阻大鼠肾间质纤维化及低氧诱导因子-1α表达的影响

[目的] 通过单侧输尿管梗阻（UUO）大鼠模型探讨“黄芪-丹参”对于肾间质纤维化和肾小管上皮细胞转分化（EMT）的作用以及缺氧诱导因子（HIF）-1α表达的影响。[方法] 将大鼠分为假手术组、模型组、芪参低剂量组、芪参中剂量组、芪参高剂量组、氯沙坦组。采用UUO模型并灌胃、取材。Masson染色法观察大鼠肾脏组织病理改变;免疫组化法检测大鼠肾脏组织α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）表达;PCR法检测大鼠肾脏组织1型胶原蛋白（Col1）、纤连蛋白（FN）mRNA表达;蛋白免疫印迹（Western Blot）法检测大鼠肾脏组织HIF-1α蛋白表达。[结果] Masson染色：模型组与假手术组比较,胶原容积升高,差异具有统计学意义（P＜0.001）;芪参中、高剂量与模型组比较出现下降,差异具有统计学意义（P＜0.01）;氯沙坦组与模型组比较下降,差异具有统计学意义（P＜0.001）。免疫组化：大鼠模型组与假手术组比较,α-SMA蛋白表达升高,差异具有统计学意义（P＜0.001）;芪参中、高剂量以及氯沙坦组与模型组比较,α-SMA均下降,差异具有统计学意义（P＜0.01）。实时荧光定量聚合酶链式反应（PCR）检测：模型组对比假手术组,Col1、FN表达水平升高（P＜0.001）,药物组与模型组比较Col1、FN表达降低,差异具有统计学意义（P＜0.05）。Western Blot检测：模型组与假手术组比较,HIF-1α表达升高,差异具有统计学意义（P＜0.001）;芪参中剂量较模型组有下降,差异具有统计学意义（P＜0.01）。[结论] “黄芪-丹参”药对可以通过抑制细胞外基质的生成以及减轻肾小管上皮细胞-间充质细胞转分化两个方面延缓肾间质纤维化,其机制可能与抑制HIF-1α表达有关。     

糖肾1号方含药血清对高糖环境下培养的HK-2细胞中TGF-β1、α-SMA、FNmRNA和蛋白水平的影响

[目的]观察糖肾1号方含药血清干预高糖环境下培养的人肾小管上皮细胞(HK-2)中转化生长因子-β1(TGF-β1)、α-平滑肌蛋白(α-SMA)、纤维连接蛋白(FN)mRNA和蛋白水平,初步探索糖肾1号方治疗糖尿病肾病可能的作用机制。[方法]选用HK-2细胞,分为空白组、高糖组、空白血清组、糖肾1号方含药血清低剂量组、糖肾1号方含药血清高剂量组。高糖环境下培养24 h后,进行血清干预24 h,培养48 h后收集细胞,通过逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)和蛋白免疫印迹(Western Blot)法检测HK-2细胞中TGF-β1、α-SMA、FN mRNA和蛋白表达水平。[结果]1)与空白组相比,高糖组的TGF-β1、α-SMA、FN mRNA和蛋白表达水平明显增多,差异具有统计学意义(P0.05)。2)与高糖组相比,糖肾1号方低剂量组、糖肾1号方高剂量组TGF-β1、α-SMA、FN mRNA表达水平减少,差异具有统计学意义(P0.05)。3)与高糖组相比,糖肾1号方低剂量组FN蛋白表达水平减少,差异具有统计学意义(P0.05),糖肾1号方高剂量组α-SMA、FN蛋白表达水平减少,差异具有统计学意义(P0.05)。4)与糖肾1号方低剂量组相比,糖肾1号方高剂量组TGF-β1、FN mRNA降低,差异具有统计学意义(P0.05)。[结论]糖肾1号方含药血清可抑制TGF-β1、α-SMA、FN mRNA和α-SMA、FN蛋白表达水平,糖肾1号方高剂量组效果优于糖肾1号方低剂量组。