黏液型铜绿假单胞菌PA2815基因的敲除与功能鉴定

目的构建黏液型铜绿假单胞菌64(PA-64)株2815基因敲除株PA-64/ΔPA2815,建立有效的PA2815基因敲除平台。方法利用自杀质粒p CVD442及基因同源重组技术敲除PA-64株PA2815基因,并采用PCR及测序检测方法筛选获得PA2815基因被Gm抗性基因取代的克隆,命名为PA-64/ΔPA2815。比较敲除株与野生株之间的生长特性、抗生素的敏感性、藻酸盐以及绿脓菌素分泌的差异。结果 PA-64/ΔPA2815菌株与野生株的PA2815基因两侧同源臂片段PCR产物相比缺少1 480 bp,成功构建了黏液型铜绿假单胞菌PA2815基因敲除株。体外实验证实敲除株相比野生株生长速度略慢,藻酸盐分泌显著降低,差异有统计学意义(P0.05),而绿脓菌素分泌显著升高(P0.05),但在抗生素的敏感性方面差异无统计学意义(P0.05)。结论利用同源重组原理成功构建黏液型铜绿假单胞菌PA2815基因敲除平台;PA2815基因不影响黏液型铜绿假单胞菌对抗生素的敏感性,但可以正向调控其藻酸盐的分泌和菌落生长状态,负向调控绿脓菌素的分泌。     

肠道病毒71型能诱导THP-1巨噬细胞的自噬和凋亡

目的 探讨肠道病毒71型（EV71）诱导THP-1巨噬细胞自噬和凋亡及其相关信号通路。方法 设置EV71处理组和DMEM对照组,EV71处理组是用感染复数0.1感染THP-1巨噬细胞2、8和16 h,对照组是用DMEM培养基作为阴性对照即是0 h组。CCK-8检测EV71对THP-1巨噬细胞增殖和毒性的影响;荧光定量PCR法检测EV71在细胞内病毒核酸变化情况;透射电镜观察THP-1巨噬细胞内超微结构变化;Hoechst 33342染色法和AnnexinV/PI 双染法检测EV71诱导THP-1巨噬细胞凋亡的情况; 免疫印迹法分析EV71诱导THP-1巨噬细胞自噬和凋亡相关蛋白水平的变化;用3-MA和Ac-DEVD-CHO抑制剂分别检测EV71对THP-1巨噬细胞自噬和凋亡的影响。结果 EV71作用THP-1巨噬细胞2、8和16h的细胞存活率逐渐下降（P<0.05）;细胞内病毒核酸拷贝数逐渐增多（P<0.01）;可见细胞内自噬小体和病毒颗粒;总细胞凋亡率逐渐增加（P<0.01）;与对照组比较,EV71处理组LC3转化量（LC3-II/LC3-I）逐渐增多,而p62蛋白逐渐减少,cleaved caspase 3蛋白增多,Bcl-2和caspase-3蛋白减少（P<0.01）,而cleaved caspase-8无差异（P>0.05）;与PBS对比,在8 h时3-MA明显抑制EV71诱导THP-1巨噬细胞自噬,LC3-II/LC3-I比值减少,而p62蛋白增多（P<0.01）;与DMSO对比,Ac-DEVD-CHO明显抑制EV71诱导THP-1巨噬细胞凋亡,凋亡率分别为15.5%和7.7%（P<0.01）。结论 EV71能感染THP-1巨噬细胞并在其中复制,且能诱导自噬和凋亡,其可能与激活LC3/p62自噬途径和caspase凋亡途径有关。     

细胞自噬减缓PM2.5诱导的人肺腺癌细胞系H441凋亡

目的探讨细胞自噬在PM2.5诱导细胞凋亡过程中的作用机制。方法采集2016年湛江市细颗粒物PM2.5,再用不同浓度PM2.5,分不同时间处理人肺腺癌(H441)细胞;用MTT比色法检测细胞增殖;PI和annexin V双染及TUNEL法检测细胞凋亡;蛋白免疫印迹法检测自噬标志物LC3Ⅱ及AKT和P-AKT蛋白表达。将H441细胞用雷帕霉素或3-MA预处理后,再用PM2.5暴露处理,锥虫蓝染色检测细胞活力。结果与对照组相比,100μg/m L以上PM2.5处理24和48 h组细胞增殖明显受到抑制;随着PM2.5作用浓度的增加,细胞凋亡率明显增加,LC3Ⅱ蛋白的表达明显增多,P-AKT蛋白表达明显减少;而使用AKT抑制剂后,LC3Ⅱ蛋白增加愈明显;PM2.5暴露下,应用雷帕霉素能够降低PM2.5引起的细胞凋亡,而3-MA可促进PM2.5引起的细胞凋亡。结论在H441细胞中,PM2.5通过抑制AKT活化而激活细胞自噬发生,而细胞自噬能够减缓PM2.5诱导的细胞凋亡。     

黏液型与非黏液型铜绿假单胞菌的比较蛋白组学分析

目的 探讨黏液型与非黏液型铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa,P.a)的差异蛋白谱,以发现黏液型P.a潜在的生物标志物.方法 采用来自于临床囊性纤维化患者分离的3株黏液型P.a菌株,脉冲场凝胶电泳以确定它们的同源性;采用同位素相对和绝对定量标记(isobaric tags for relative and absolute quantitation,iTRAQ)结合二维液相色谱串联质谱(two-dimensional liquid chromatography-tandem mass spectrometry,2D LC-MS/MS)技术分析3株黏液型与对照组1株非黏液型P.a的差异蛋白谱,并采用RT-qPCR方法对5个共同差异蛋白进行验证.结果 3株黏液型P.a菌株不具有同源性,iTRAQ结果没有明显差异.3组共有219个上调和101个下调差异蛋白.pa2815、pa2018、dnak、pa5046和acef基因转录水平与iTRAQ结果一致.结论 不同黏液表型P.a的iTRAQ结果没有明显差异,219个上调和101个下调差异蛋白可以作为研究黏液型与非黏液型P.a致病机制的候选生物标志物.     

miR-363-3p和miR-5100在非小细胞肺癌中的表达及其临床意义

目的:探讨小分子RNA(microRNA)miR-363-3p 和miR-5100在非小细胞肺癌中的表达及其临床意义.方法:利用荧光定量PCR的方法,检测肿瘤组织、癌旁组织及远离肿瘤的正常组织中致癌基因Myc的mRNA 和miR-363-3p、miR-5100的表达,然后分析miR-363-3p 和miR-5100与临床病理特征之间的相关性.结果:Myc在肿瘤组织中表达明显升高;miR-363-3p在肺癌组织中的表达明显低于正常组织(P<0.001),而在癌旁组织中的表达却远远高于正常组织(P<0.05);miR-5100在肺癌组织中的表达显著地高于正常组织(P<0.001),并且癌旁组织中的表达也高于正常组织(P<0.05).临床相关性分析显示,miR-363-3p的表达与淋巴结转移呈正相关(P<0.001),miR-5100的表达与临床分期也呈正相关性(P<0.05).结论:miR-363-3p 和miR-5100可能参与了非小细胞肺癌早期的发生和转移,并可能作为早期诊断和预后的分子标志物.     

人8-羟基鸟嘌呤DNA糖苷酶1与肺癌

人8-羟基鸟嘌呤DNA糖苷酶1（hOGG1）功能异常与肺癌等癌症发生发展密切相关,hOGG1基因多态性可能会改变酶的活性,从而影响个体损伤DNA的修复能力,促进癌变.hOGG1等DNA修复基因单核苷酸多态性联合效应提高人群肺癌的易感性.hOGG1参与调节肿瘤细胞的线粒体呼吸功能并影响肿瘤细胞生长.