大鼠肺鳞癌组织中Pokemon基因与MDM2基因表达的相关性

目的:探讨原癌基因Pokemon与癌基因MDM2在大鼠肺鳞癌发生发展过程中的表达及意义.方法:采用Wistar大鼠实验组灌注三甲基胆蒽与二乙基亚硝胺诱癌,对照组灌注碘油,采用原位杂交法检测肺鳞癌发生、发展各阶段的基因转录及表达水平.结果:实验组诱癌率为80％,其中支气管黏膜上皮增生28％,不典型增生17.3％,原位癌37.3％,侵袭癌26.7％,转移癌21.3％.Pokemon基因对照组与不典型增生组、鳞癌组比较差异有统计学意义;转移癌组和非转移癌组比较差异有统计学意义.MDM2基因对照组与不典型增生组、鳞癌组比较差异有统计学意义,转移癌与非转移癌比较差异有统计学意义.Pokemon基因与MDM2基因两者表达呈正相关.结论:Pokemon基因与MDM2基因在大鼠肺鳞癌的演进过程中呈现逐渐的高表达,两者可能共同参与了大鼠肺鳞癌的发生、发展过程.     

鸡胚发育过程中Shh超表达对脊髓神经纤维投射的抑制作用

目的探讨鸡胚发育过程中,sonic hedgehog(Shh)在脊髓中超表达后对神经纤维投射的影响。方法在鸡胚龄2.5~3d(E2.5~E3)时,利用鸡胚活体原位电转基因技术将Shh表达质粒和携带有报告基因绿色荧光蛋白(GFP)的质粒共转入鸡胚脊髓,E6时取材切片,至少取3个材料,免疫荧光技术检验Shh的超表达,利用Open Book技术研究Shh在鸡胚脊髓中超表达后对神经纤维投射的影响。结果在脊髓组织切片水平上,免疫荧光结果表明,Shh在鸡胚脊髓中成功超表达,无论在组织切片上还是通过Open Book技术进行观察,与对照组相比,超表达后转染侧神经纤维都无法正常通过底板投射到对侧,表明Shh在鸡胚脊髓神经纤维投射方面具有重要作用。结论在鸡胚发育过程中,脊髓中Shh超表达后对神经纤维投射具有抑制作用。     

应用鸡胚活体电转GFP示踪技术观察脊髓左右两侧神经元纤维投射

目的:探索鸡胚发育过程中,脊髓左右侧神经元经纤维之间的联系,为脊髓两侧神经纤维投射提供形态学基础;方法:采用鸡胚带壳开窗培养技术,待胚胎发育至第3天,通过活体电转基因,将pCAGGS-GFP质粒0.1～0.5μl准确注射到脊柱,在电压18 V、每次脉冲60 ms,间隔100 ms,电脉冲6次的条件下进行定时定位活体电转基因,电转后6小时开始到10天,分别收集胚胎,甲醛固定冰冻切片,DAPI染细胞核观察组织形态结构变化。结果:电转后6小时便可以观察到GFP的表达,24小时后可以看到GFP标记细胞纤维的投射,3天可以清晰的观察到转入GFP一侧脊髓的运动神经元纤维束投射到另外一侧脊髓。结论:电转GFP成功标记运动神经元纤维在脊髓左右两侧的投射。     

鸡胚培养及活体电转基因方法的建立

Objective To establish the methods of EM>in ovo/EM> and EM>ex ovo/EM> culture of chicken embryo as well as EM>in vivo/EM> electroporation. Methods Fertile eggs were incubated for two to three days（E2-E3）, and in ovo electroporation in spinal cord at E2-E3, and ex ovo electroporation in the tectum of brain at E5-E6 for spatial and temporal gene transformation with the parameter such as volt 18V, current 60mA, pause 90ms, and pulse 60ms for six times were carried out. Results The number of samples were 20 eggs for EM>in ovo/EM> culture and 10 eggs for EM>ex ovo/EM> culture. The survival rate of the embryos at E2-E3 was 85% for EM>in ovo/EM> culture and 80% for EM>ex ovo/EM> culture. The number of samples were 11 in spinal cord at E2-E3 ( in ovo electroporation) and 10 in brain tectum at E5-E6 ( ex ovo electroporation). The positive electroporation rate was 54.5% in spinal cord at E2-E3 (EM>in ovo/EM> ) and 60% in brain tectum at E5-E6 (EM>ex ovo/EM>). Conclusion The methods of in ovo and ex ovo culture of chicken embryos and in     

基于鸡胚电转技术研究脊髓神经干细胞相关基因功能方法的建立

目的建立一种基于鸡胚电转技术研究脊髓神经干细胞(NSCs)相关基因功能的方法。方法 RT-PCR检测鸡胚发育不同时期脊髓NSCs表面标志物;在鸡胚胚龄(E)E2.5~E3时,利用活体电转基因技术将p CAGGSGFP质粒转染到鸡胚脊髓,E6时体视荧光显微镜下筛选绿色荧光蛋白(GFP)阳性胚胎,每组至少取材5个;通过脊髓横切及open-book技术观察神经纤维投射情况;普通光学显微镜下剥离出3~5条脊髓,经胰蛋白酶消化、离心后,无血清NSCs培养基重悬获得细胞铺板,于37℃、5%CO_2细胞培养箱内培养,定时观察GFP阳性脊髓NSCs的形态变化。结果 RT-PCR结果表明,鸡胚脊髓中阳性表达NSCs表面标志物;随后的脊髓横切及open-book结果表明,GFP阳性转染侧的神经纤维能穿过底板,投射到脊髓对侧;而脊髓NSCs体外培养结果显示,GFP标记的脊髓细胞具有典型的NSCs形态,继续培养后有明显突起产生。结论本实验成功建立了一种基于鸡胚电转技术研究脊髓神经干细胞相关基因功能的方法。     

双色荧光示踪鸡胚脊髓两侧连合纤维投射研究方法的建立

目的建立1种双色荧光示踪鸡胚脊髓两侧连合纤维投射的实验方法。方法鸡胚孵育至胚龄2.5~3d,通过鸡胚活体原位电转基因技术将携带有报告基因绿色荧光蛋白(GFP)的质粒(p CAGGS-GFP)准确注射到鸡胚脊髓腔,实现定时、定位活体电转基因。转染后继续孵育至6d,取GFP阳性表达的胚胎,部分做脊髓横向切片,部分利用open-book技术将脊髓展开观察连合纤维的发育情况,每组至少取3个标本。其后在脊髓非转染侧连合神经元所在之处,点状注射Di I乙醇溶液,封片后于4℃避光孵育3d,在荧光显微镜下观察脊髓连合纤维投射情况。结果脊髓横切及open-book结果显示,鸡胚脊髓GFP阳性转染侧的神经元轴突穿过底板投射到脊髓对侧;同时在open-book结果中还可观察到,转染侧轴突穿过底板后分别沿腹索和外侧索向头尾部投射;Di I标记的非转染侧连合神经元轴突也同样穿过底板投射到对侧,并在侧索白质内延伸。结论本实验成功建立了1种双色荧光示踪鸡胚脊髓两侧连合纤维投射的研究方法,为研究脊髓神经发育提供技术保障。     

不同Reelin基因型小鼠海马结构组织学差异

目的通过对不同Reelin基因型小鼠海马区组织学结构的比较分析,为Reelin在海马结构形成中的作用提供依据。方法选择杂合子Reelin小鼠繁殖后代,在出生后10d进行基因型鉴定,设Reelin+/+、Reelin+/-和Reelin~-/-3组,每组3只小鼠。鉴定后的小鼠通过4%多聚甲醛心脏灌注后剥离全脑,通过多聚甲醛固定、蔗糖脱水后冷冻切片,采用4’6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)为细胞核染色,用免疫荧光标记T-box brain gene 1(Tbr-1)、神经元核抗原(Neu N)和GFAP特异性表达的细胞,光学显微镜下观察、摄片后对结果进行分析。结果从DAPI染色的细胞核及Tbr-1、Neu N和GFAP标记的细胞结构可以看出,Reelin+/+型小鼠和Reelin+/-型小鼠海马区都具有相似的结构,但将Reelin+/+和Reelin~-/-型小鼠相比较,Reelin~-/-型小鼠海马结构模糊,齿状回细胞向门区扩散,海马本部的细胞层结构紊乱,出现密集双细胞带,GFAP标记细胞减少。结论 Reelin缺失表达对小鼠大脑正常结构的形成具有明显的影响。在Reelin表达缺失后海马区齿状回细胞分布弥散,海马本部细胞层的分布紊乱,胶质细胞及纤维分布减少。     

#br# 鸡源Wnt3a融合蛋白表达载体的构建及其对鸡胚脊髓神经前体细胞增殖和轴突形成的影响

目的 构建鸡源Wnt3a 融合蛋白真核表达载体 (pCAG-MCs-Wnt3a-EGFP),并探讨其在鸡胚脊髓发育过程中超表达后对神经前体细胞增殖及轴突形成的影响。 方法 利用分子生物学手段,提取鸡胚脊髓总RNA并获得Wnt3a片段,将其克隆到pCAG-MCs-EGFP载体中构建pCAG-MCs-Wnt3a-EGFP表达载体。在鸡胚发育至2.5～3d (E2.5～E3) 时,利用鸡胚活体电转技术将pCAG-MCs-Wnt3a-EGFP（实验组）和pCAG-MCs-EGFP（对照组）质粒分别转入鸡胚脊髓,E4时取材切片,每组5个胚胎组织,采用免疫荧光染色技术检测Wnt3a和增殖细胞核抗原（PCNA）蛋白表达变化分析Wnt3a与细胞增殖间的关系,根据载体自发绿色荧光蛋白（GFP）观察脊髓神经前体细胞轴突生成情况。 结果 pCAG-MCs-Wnt3a-EGFP表达载体基因测序结果与Gene bank中基因序列一致,将pCAG-MCs-Wnt3a-EGFP导入鸡胚脊髓中发现绿色荧光。在脊髓组织切片水平上,免疫荧光染色结果表明,Wnt3a在鸡胚脊髓中能够超表达。Wnt3a超表达后,与对照组比较,含有轴突的神经元数量明显减少(n=3, P<0.01),而PCNA 的表达量显著增加(n=3, P<0.01)。 结论 成功构建了鸡源性Wnt3a 融合蛋白真核表达载体,并证实Wnt3a在鸡胚发育过程中促进神经前体细胞的增殖并抑制轴突的形成。