应用DNA探针杂交化学发光自显影检测结核分枝杆菌

本研究建立了一种无需聚合酶链反应 (ＰＣＲ)扩增将一种新的裂解液与ＤＮＡ探针、化学发光自显影优化组合成一个整体 ,,具备高敏感度和高特异性的检测结核分枝杆菌的新方法。该法操作简便、经济 ,适用于常规检测。报告如下。一、材料和方法1 仪器 :ＴＧＬ 1 6Ｇ型台式离心机 ,ＡＧ960 0型ＰＣＲ仪和ＤＹＹ34型电泳仪。2 试剂 :裂解液 (0 1ｍｏｌ/ＬＴｒｉｓＨＣｌ,0 0 1 %ＴｒｉｔｏｎＸ 1 0 0 ,0 0 5 %吐温 2 0和 1ｍｇ/ｍｌ蛋白酶Ｋ ,50ｍｍｏｌ/ＬＫＣｌ) ,Ｘ片为国产 ,硝酸纤维素膜为Ａｍｅｒｓｈｅｍ公司产品 ,链霉亲和素标记辣根…     

16S～23S rDNA间隔区序列寡核苷酸探针不同显色方法对结核患者痰标本的检测

目的：评价16S－23rDNA间隔区序列寡核苷酸探针碱性磷酸酶显色与辣根过氧化物酶化学发光学对结核患者痰标本检测的应用价值。方法：采用生物素标记5′端18bp的寡核苷酸探针斑点杂交的碱性磷酸酶显色反 辣根过氧化物酶化学发光检测90例例结核患者和30例非结核患者痰标本,结果：痰标本基因组DNA直接与探针杂交,碱性磷酸酶显色反应检测阳性率为22．2％,辣根过氧化物酶化学发光检测阳性率为33．3％,痰标本经引物PL1、PL2扩增（扩增产物350bp,）与寡核苷酸探针杂交,碱性磷酸酶显色反应检测阳性率为77．8％,辣根过氧化物酶化学发光检测阳性率为83．3％,痰标本经引物b扩增（扩增产物250bp)与探针杂交,碱性磷酸酶显色和化学发光检测阳性率分别为75．6％,80．0％,检测的敏感性高于痰涂片。寡核苷酸探针与30例非结核患者痰标本DNA杂交则全为阴性。结论：寡核苷酸探针和250bpPCR扩增产物相结合,经化学发光显色是分枝杆菌检测的一种有效方法。     

应用DNA探针直接检测结核分枝杆菌DNA

由于ＤＮＡ探针杂交反应特异性高 ,国内外研究者已采用ＤＮＡ探针杂交技术检测结核分枝杆菌。但该检测方法敏感性较低 ,通常采用与聚合酶链反应 (ＰＣＲ)扩增相结合的方法。但这样增加了实验的费用和交叉污染的机会。我们在对ＤＮＡ探针与ＰＣＲ结合检测临床标本进行系统研究的基础上 ,发现临床标本简化法处理 ,即ＤＮＡ探针化学发光检测 ,ＤＮＡ损失较少 ,还可提高检测的敏感性 ,现将结果报道如下。材料与方法一、菌种来源受试分枝杆菌标准株来自中国药品生物制品检定所。二、标本收集结核患者痰标本 2 31份 ,血液标本 85份 ,脑脊液、胸、…     

rDNA探针杂交检测病人痰标本中结核杆菌的研究

目的 应用结核分枝杆菌特异的rDNA探针杂交检测痰标本中的结核杆菌rDNA,评价其在临床标本检测中的应用价值。方法 用引物b对结核分枝杆菌16S-23SrDNA间隔区序列进行扩增,同时加入生物素标记,制成250bp的rDNA探针。对该探针的敏感性、特异性进行了研究,并对90份结核病人,30份非结核病人痰标本的PCR产物进行了斑点杂交检测。结果 rDNA探针检测引物bPCR扩增产物的敏感性为100pg。rDNA探针与受试24种分枝杆菌和11种非分枝杆菌引物bPCR扩增产物杂交只有结核分枝杆菌、胃分枝杆菌为阳性杂交,特异性较高。而rDNA探针对90份结核病人痰标本引物b扩增产物检测的阳性率为80.2%,高于PCR扩增产物电泳检测结果 (64%)。rDNA探针与30份非结核病人痰标本杂交结果均为阴性杂交。结论 rDNA探针与引物bPCR扩增相结合能提高结核病人痰标本检测的敏感性与特异性。     

常见革兰阳性细菌鉴定与耐药检测基因芯片的临床应用

目的利用基因芯片技术进行常见革兰阳性细菌的细菌鉴定和耐药性检测。方法用生理生化鉴定和药敏纸片法确定445份革兰阳性细菌菌株的细菌种类和耐药性,盲法进行革兰阳性细菌鉴定与耐药检测基因芯片的检测,用SPSS 10.0 for Windows软件统计分析。结果与临床常规方法相比,耐药检测基因芯片鉴定指标的灵敏度均>96%,特异度均>98%;耐药检测指标的灵敏度均>94%,特异度均>90%。χ2检验结果P值均>0.05,基因芯片检测结果与临床常用方法检测结果差异无统计学意义。Kappa值均>0.75,2种方法一致性较好。结论基因芯片技术对细菌鉴定和耐药检测有一定的临床应用价值。     

两种DNA探针杂交检测结核分枝杆菌的研究

我们比较了结核分枝杆菌 (结核菌 )基因组ＤＮＡ及其聚合酶链反应 (ＰＣＲ)产物的灵敏度与特异性 ,并对结核病人痰标本进行了检测。一、材料和方法1 菌种来源 :2 4种分枝杆菌来自中国药品生物制品检定所 ,11种非分枝杆菌来自中国科学院微生物学研究所。2 标本收集 :90份痰标本来自本院结核科住院病人 ,经Ｘ线检查、临床表现确诊。 30份非结核病人痰标本来自本院呼吸科、肿瘤科及北京大学第三医院呼吸科住院病人。3 标本ＤＮＡ提取 :采用本室研制的标本前处理试剂盒。4 引物 :引物ａ :根据文献 [1]报道设计。扩增产物为35 0ｂｐ ,5′ ＧＡＡ…     

16S-23S rDNA间隔区序列寡核苷酸探针对结核患者痰标本的检测

目的：应用结核分枝杆菌特异的寡核苷酸探针杂交检测结核患者痰标本中的结核分枝杆菌，以评价其在临床应用中的价值。方法 对生物素标记５‘－端的一个２０ｂｐ的寡核苷酸探针的敏感性、特异性的研究，并应用该探针对９０例结核患者和３０例非结核患者痰标本进行了检测。结果 寡核苷酸探针分别检测基因组ＤＮＡ、３５０ｂｐ ＰＣＲ扩增产物、２５０ｂｐ ＰＣＲ扩增产物的敏感性分别为５５ｎｇ，０．５ｎｇ，０．１ｎｇ。探针检测     

用DNA芯片检测结核分枝杆菌耐乙胺丁醇基因突变的研究

目的利用DNA芯片快速检测结核分枝杆菌耐乙胺丁醇embB基因突变。方法根据结核分枝杆菌embB基因序列设计探针并制作DNA芯片。根据结核从分枝杆菌embB基因突变的热点片段设计引物，该片段用TAMRA荧光标记PCR扩增增后与DNA芯片杂交，同时以PCR-SSCP和DNA测序法为对照。结果120株结核分枝杆菌临床分离株中，35株敏感株DNA芯片杂交结果与标准株完全相同；85株耐乙胺丁醇临床分离株中有50株检测到embB基因突变[58．8％（50／85）]，均为306位密码子突变，该突变与PCR．SSCP和测序结果完全一致；85株耐药株中后有35株未检测到突变，占41．2％（35／85）。结论用DNA芯片可快速、特异地检测出大多数结核分枝杆菌耐乙胺丁醇分离株的embB基因突变，可协助临床医生制定合理的治疗方案，特别是复治患者，可帮助选择有效药物。     

直接杂交法检测痰液中结核分枝杆菌

目的 建立了一种高度灵敏、特异、快速和简便的探针杂交检测技术，以解决临床上结核病快速诊断的难题。方法 采用简易的方法处理标本，以对结核分枝杆菌特异的生物素标记188bpDNA探针进行点杂交，与链霉亲合素标记的辣根过氧化酶偶联后，以化学发光自显影方式记录检测信号。结果 此法的第三性可检出200个菌，较PCRI地为高，对20种分枝杆菌和9种非分枝杆菌检测时发现只有结核分枝杆菌呈阳性，以本法检测104例临床标本。结果发现，对其中45例结核病人痰涂片阳性标本。41例结核病人痰涂片阴性标本和18例非结核标本。检测阳性率分别为100%、65.9%和0.0%。结论 本法简便，特异。