内参基因GAPDH和β-actin在BMP9诱导的骨髓间充质干细胞成骨分化过程中的表达情况

目的:观察常用内参基因甘油醛-3-磷酸脱氢酶(glceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)和β肌动蛋白(β-actin)在骨形态发生蛋白9(bone morphogenetic proteins 9,BMP9)诱导的骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)成骨分化过程中表达情况,以确定相关研究的内参基因。方法:检测碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)确定BMP9诱导的MSCs(包括C3H10、C2C12和MEF)向成骨分化;以real-time PCR分别检测0、1、3、5、7 d GAPDH和β-actin的m RNA表达水平;以Western blot检测GAPDH和β-actin蛋白。结果:(1)β-actin在BMP9诱导的MSCs成骨分化过程中m RNA表达水平逐渐升高,0 d与5 dβ-actin的m RNA表达量存在统计学差异(C3H10、C2C12和MEF的P值均为0.000,GAPDH的m RNA表达水平未见明显改变(P>0.05);β-actin蛋白表达量随成骨分化逐渐增加,而GAPDH蛋白表达未见明显变化。结论:在BMP9诱导的MSCs成骨分化过程中,GAPDH比β-actin更适合做内参。     

携带siRbpj重组腺病毒载体的构建及其对BMP9诱导骨髓间充质干细胞成骨分化作用影响

目的：构建并筛选特异性干扰Notch信号通路核转录因子Rbpj基因的重组腺病毒,探讨通过Rbpj的经典Notch信号通路在骨形态发生蛋白（bone morphogenetic protein,BMP）9诱导骨髓间充质干细胞（mesenchymal stem cells,ＭＳＣs）成骨分化中的作用。方法：设计3对针对小鼠Rbpj的siRNA序列,将其分别亚克隆至pSES-HUS穿梭质粒,再与骨架质粒pAdEasy-1在大肠杆菌BJ5183内同源重组获得重组质粒,经脂质体转染至HEK293细胞中包装扩增腺病毒,利用RT-PCR及Western blot进行筛选、验证有效的干扰腺病毒。该重组腺病毒与AdBMP9处理ＭＳＣs细胞株C3H10T1/2,采用组织化学和RT-PCR检测早期成骨指标碱性磷酸酶（alkaline phosphatase,ALP）和晚期成骨指标骨桥蛋白（osteopontin,OPN）,骨钙蛋白（osteocalcin,OCN）及BMP下游靶基因Id 1、Runx 2等的表达。结果：成功构建了3个重组腺病毒,并筛选出干扰效率最好的AdsiRbpj-2重组腺病毒,转染C3H10T1/2,AdsiRbpj-2可以明显下调BMP9诱导的早期成骨指标ALP的活性及晚期成骨指标OPN、OCN的表达,成骨相关基因Runx 2等的表达也有下降。结论：成功构建了特异性阻断Notch经典信号通路腺病毒载体AdsiRbpj-2,该重组腺病毒能够抑制BMP9诱导的C3H10T1/2细胞的成骨分化进程,从而进一步证明Notch信号通路在BMP9诱导的MSCs成骨分化过程中有着重要的作用。     

不同分子生物学方法在手足口病标本检测中的应用

目的:探讨不同分子生物学方法监测手足口病标本的效果。方法:选择本院2017年3月-2018年4月接收的64例手足口病患儿为研究对象,采集患儿的标本,采用分子生物学方法检测患者手足口病标本,具体分为实时RT-PCRZ法、一步RT-PCRZ法、巢式PCR法检测,比较三种不同分子生物学方法检测标本中EV71、CA16病原阳性率。结果:应用实时RT-PCRZ法、巢式PCR法检测手足口病标本中EV71、CA16病原的阳性率明显高于一步RT-PCRZ法,差异有统计学意义(P0.05)。结论:手足口病标本检测中,应用RT-PCRZ法、巢式PCR法有非常高的检测准确率,值得临床推广。     

DLL1在骨形态形成蛋白9诱导骨髓间充质干细胞成骨分化中的作用

目的 探讨Notch配体Delta-like1(DLL1)在骨形态形成蛋白9(bone morphogenetic proteins 9,BMP9)诱导的骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)成骨分化中的作用及机制.方法 利用DLL1重组腺病毒上调永生化小鼠胚胎成纤维细胞(immortalized mouse embryonic fibroblasts,iMEF)中DLL1 mRNA的表达,分别采用细胞化学染色、活性测定对早期成骨指标碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)和晚期成骨指标钙盐沉积的影响;其次裸鼠皮下异位成骨实验进一步了解DLL1的体内成骨作用;最后用qRT-PCR、Western blot和荧光素酶检测DLL1对BMP9经典信号通路中Ⅰ型受体、Smad1/5/8磷酸化和Smad结合元件(smad-binding element,SBE)转录活性影响.结果 与对照组相比,DLL1在体外能明显促进BMP9诱导的MSCs早期成骨指标ALP活性和晚期成骨指标钙盐沉积的生成;同时也能明显促进BMP9诱导的MSCs裸鼠皮下异位成骨作用;BMP9信号通路中ALK2表达明显增加,而对ALK1则没有影响;Smad1/5/8蛋白量没有明显变化,而p-Smad1/5/8蛋白及SBE活性明显增加(P＜0.05).结论 DLL1可以促进BMP9诱导的MSCs成骨分化,可能通过影响BMP9信号通路来实现其促成骨作用.