构建预设CDR3基因噬菌体抗体库筛选抗人整合素ανβ3 mAb的人源化Fab

目的:构建预设CDR3基因的噬菌体抗体库,通过抗原表位导向选择方法筛选抗人整合素ανβ3单克隆抗体(mAb)人源化Fab。方法:将鼠mAbLCDR3重组到人轻链可变区文库中并与人/鼠嵌合重链Fd基因配对构建杂合噬菌体抗体库,用固相人整合素ανβ3抗原筛选人源化轻链基因。再用所获人轻链基因与移植有鼠mAbHCDR3的人重链Fd基因配对构建人源噬菌体抗体库,筛选人源化Fab。结果:分别构建了库容为2.1×106和2×107的杂合噬菌体抗体库和人源噬菌体抗体库,筛选到3株人源Fab克隆。经间接ELISA及竞争抑制ELISA证实,能特异结合整合素ανβ3抗原,其中人源D5株Fab克隆的基因序列表明,人轻链可变区基因属VKIII亚群,人重链可变区基因属VH1亚群。结论:利用噬菌体抗体库技术,成功地进行了鼠抗人整合素ανβ3mAbE10人源化的改造,为进一步临床应用奠定了基础。     

人源抗HAV噬菌体抗体的筛选及基因序列分析

目的获得人源性甲型肝炎病毒（ＨＡＶ）抗体。方法应用抗体捕获的ＨＡＶ，从本实验室构建的噬菌体抗体组合文库中筛选与ＨＡＶ病毒有结台活性的人源噬菌体抗体（Ｆａｂ段），用夹心ＥＬＩＳＡ和竞争抑制实验测定其活性及特异性。结果筛选出与ＨＡＶ病毒有结台活性和特异性的人源抗体。序列分析表明重链基因为ＩｇＧＩ亚类，可变区属ＶＨＩ亚群，是ＤＰ８８、Ｄ３—３和ＪＨＳ胚系基因片段的重排产物；轻链基因属ＶＸｌｌｌ亚群，是ＤＰＸ２２和Ｊｋ４胚系基因的重排产物。结论应用抗体捕获抗原的方法，能从该抗体库筛选出ＨＡＶ抗体，也说明该抗体库的构建是成功的。     

丙型肝炎病毒NS3蛋白酶结构域在昆虫细胞中的表达及鉴定

目的　利用杆状病毒 昆虫细胞表达系统制备丙型肝炎病毒 (HCV)丝氨酸蛋白酶结构域 (proteasedomain)的重组蛋白。方法　构建含有HCV丝氨酸蛋白酶结构域基因的杆状病毒转移载体 pFBCNS3N ,转化大肠杆菌DH10Bac进行转座 ,提取重组Bacmid用Lipofectamine法转染昆虫细胞Sf9包装成重组杆状病毒。用重组杆状病毒感染昆虫细胞进行蛋白表达 ,用SDS PAGE电泳和免疫印迹实验分析表达情况 ;利用去垢剂十二烷基肌酸钠溶解重组蛋白后以Ni NTAagrose柱亲和纯化重组蛋白 ;以重组蛋白NS5ab(包含NS5A羟基端部分和NS5B氨基端部分的重组蛋白 )为底物检测丝氨酸蛋白酶的酶切活性 ;以间接ELISA法分析重组蛋白的抗原性。结果　HCV丝氨酸蛋白酶结构域基因在昆虫细胞中获得高水平表达 ;重组蛋白能够部分溶解于含有去垢剂十二烷基肌酸钠的缓冲液 ;从 5× 10 7细胞中总共获得 0 .2mg重组蛋白 ,纯度大于 90 %;重组丝氨酸蛋白酶能够将NS5ab切割成两个片段 ;血清学实验证实该蛋白抗原性很好。结论　昆虫细胞表达的HCV丝氨酸蛋白酶结构域为膜结合型蛋白 ,具有良好的酶学活性以及抗原性。     

克隆的丙型J肝炎病毒NS2基因中发现数个N端终止突变序列

探讨丙型肝炎病毒(HCV)准种在NS2区的基因结构特征.利用逆转录-巢式PCR从一份HCV慢性携带者的阳性血清及一份急性丙肝患者的血清中获得HCV NS2全长cDNA,将其克隆于T载体,各随机挑取5个阳性克隆进行序列测定.结果显示在克隆到的HCV NS2全长基因中,慢性携带者该区序列有一个于HCV多聚蛋白第835位氨基酸的位置出现终止信号,丙肝患者该区序列有三个于第835位氨基酸的位置出现终止信号,一个小于第887位氨基酸的位置出现终止信号.在克隆到的HCV NS2基因中存在多个N端终止突变序列,提示NS2 N端跨膜区可能与包膜蛋白区有着密切的联系.     

应用随机PCR技术制备靶基因文库随机片段

目的　用随机PCR技术制备构建靶基因文库的随机基因片段。方法　先扩出靶基因 (HIV1Envgp160 )片段 ,然后设计两条引物 ,1条为锚定随机引物用于扩出靶基因的随机片段 ,另 1条为锚定特异引物用于对随机片段进行扩增 ,得到大量的随机片段 ;优化模板量、dNTP浓度、反应时间、温度和DNA聚合酶等反应条件 ,扩出靶基因的随机片段。结果　得到用于建库的理想靶基因随机片段。结论　随机PCR是制备靶基因文库随机片段的一个简便有效方法。     

丙型肝炎病毒NS5ab区的B细胞模拟表位的确认

目的：用噬菌体展示随机肽库研究丙型肝炎病毒(HCV)NS5ab区的B细胞表位。方法：在原核系统中表达了HCV NS5ab重组蛋白，亲和层析纯化血清中抗HCV NS5ab的特异多抗，用此多抗来筛选噬菌体递呈随机12肽库，获得HCV NS5ab区的B细胞表位。结果：成功地表达了HCV NS5ab重组蛋白，用此蛋白检验了130份HCV阳性血清，阳性率为36％。在筛选的噬菌体展示随机肽库后，挑取13个阳性克隆测序，有9个序列不同，最终通过噬菌体表位表达的方法确认了3个表位。结论：筛选噬菌体展示随机肽库研究HCV的B细胞模拟表位是可行的。     

噬菌体抗体库技术的应用现状

噬菌体抗体库是抗体组合文库技术和噬菌体表面展示技术相结合形成的一项新技术,近年来已经逐渐成为基因工程抗体研究的关键技术,被广泛应用于生命科学的许多方面。本文着重对该技术在医学微生物学、自身免疫性疾病、肿瘤研究以及疾病诊治等方面的应用情况进行综述,同时也对其应用前景进行预测。     

人噬菌体抗体库的构建和甲肝抗体的筛选

目的　构建人噬菌体抗体组合文库,筛选人单克隆抗体。方法　用RTPCR扩增人全套抗体基因片段,克隆于pComb3载体,电转化E.coli形成噬菌体抗体库;以固相化抗原淘筛抗体库,ELISA鉴定噬菌体抗体。结果　17对免疫球蛋白引物全部能够扩增出目的片段;经数次电转化构建了库容为693×107的抗体库,滴度为8×1014PFU/ml,Fab基因重组率为40%。以单抗捕获的甲肝抗原淘洗3轮,出现特异性富集;阳性克隆经直接ELISA和竞争抑制性ELISA实验证实具有良好的抗甲肝抗原特异性,无交叉反应性。结论　成功构建了抗体组合文库,从中获得抗甲肝抗原的特异性人抗体。     

应用随机PCR方法鉴定一株肠道病毒

目的 从基因水平对一肠道病毒分离株进行分析鉴定,方法 提取病毒RNA,以锚定随机引物反转录合成双链cDNA,用锚定特异引物进行随机扩增,扩增产物进行克隆,测序和序列分析。结果 随机扩增的病毒基因在电泳上呈典型的smear带型;11个随机克隆经GenBank检索,与肠道病毒成员具有最高的同源性且同源率超无穷大0%;11个克隆随机分布于病毒的基因组中,排定后的序列形成4个毗连序列群,共计2261个碱基,涵盖病毒基因组的30%;部分序列与柯萨奇病毒B6型氨基酸同源率达97.3%,参照测定序列合成的引物能够特异性地扩增病毒基因。结论 经序列分析证实小RNA病毒XJ90株为肠道病毒科成员。     

抗甲型肝炎病毒抗体Fab在大肠杆菌中的表达

目的 在大肠杆菌中高效表达人源抗HAV抗体Fab，为进一步研究该抗体的功能奠定基础。方法 依次将抗HAV抗体的Fd及轻链基因克隆到表达载体pASK84的不同信号序列下，构建成Fab表达质粒，在大肠杆菌JM83中进行表达，并对表达产物进行复性。用SDS－PAGE、western blot和ELISA法检测Fab的表达及其与甲肝病毒抗原的结合活性。结果 构建了抗HAV Fab的重组表达质粒p84Fab，在大肠杆菌JM83中获得表达，表达的Fab占全菌的25％，主要以包涵体形式存在，复性后具有抗原结合活性；培养基、菌体可溶性蛋白部分也能检测到有抗原结合活性的Fab。结论 抗HAV抗体Fab在大肠杆菌中得到了表达，并具有良好的抗原结合活性。