一种快速获得Vav1基因敲除稳定细胞系的方法

目的建立一种快速获得Vav1基因敲除稳定细胞系的方法。方法构建针对小鼠Vav1基因的特异性打靶载体,利用脂质体转染法转染B16小鼠黑色素瘤细胞,使用流式细胞仪对GFP阳性单细胞进行分选,对得到的GFP阳性单克隆细胞使用直接裂解法获取基因组DNA,将其用于荧光PCR,产物通过毛细管电泳和分析后即可快速获知其基因型。结果使用以上方法在短时间内得到了大量GFP阳性单克隆细胞,从中随机挑选16个,通过荧光PCR检测其基因型,结果表明敲除效率为87.5%;通过测序对部分荧光PCR结果进行验证,发现其基因型结果完全正确。结论将CRISPR/Cas9基因编辑系统、流式细胞仪单克隆分选、荧光PCR和大批量DNA样本处理技术结合,可以短时间内在B16小鼠黑色素瘤细胞中获得大量Vav1基因敲除稳定单克隆细胞。