壳聚糖-明胶-果胶仿生网络膜对间充质干细胞增殖和矿化的影响

目的：探讨采用壳聚糖、明胶和果胶制备的仿生网络膜对间充质干细胞（MSCs）增殖和矿化的影响,评价其用于构建组织工程骨的可行性。方法：采用仿生学方法,将壳聚糖、明胶和果胶按照一定比例制作成新型仿生网络膜。实验分为对照组（MSCs+常规培养基）、材料组（MSCs+网络膜+常规培养基）和材料+成骨诱导培养基（OS）组（MSCs+网络膜+OS培养基）。倒置相差显微镜下观察细胞形态表现,扫描电镜（SEM）观察细胞生长及细胞外基质分泌情况,MTT法检测细胞增殖情况（MSCs分为阴性对照组和材料组,分别以空白培养液和含材料的培养液培养）,茜素红染色检测细胞中钙无机物表达情况,实时聚合酶链反应（Real time-PCR）测定细胞中骨钙素（OC） mRNA和骨桥蛋白（OPN） mRNA表达水平。结果：网络膜材料呈半透明薄膜状,倒置相差显微镜下MSCs为短梭形,细胞成簇状聚集生长。SEM下观察,细胞培养第7天可见梭形细胞;培养第14天时细胞数量增多,以伪足状突起锚定于材料表面;培养第21天时,细胞聚集并分泌大量细胞外基质。材料组细胞增殖水平与阴性对照组比较差异无统计学意义（P>0.05）。茜素红染色,网络膜上细胞被染成橘红色。Real time-PCR法,材料组和材料+OS组MSCs中OC mRNA在接种后第7和14天时表达水平较低,第21天时其表达水平明显升高,达到峰值;OPN mRNA在第7天明显表达,第14天时表达水平达峰值,第21天略有下降;与对照组比较,不同时间点材料组和材料+OS组细胞中OC mRNA和OPN mRNA表达水平明显升高（P<0.01）,而材料组与材料+OS组比较差异无统计学意义（P>0.05）。结论：壳聚糖-明胶-果胶仿生网络膜具有良好的生物相容性,MSC在其表面可正常生长和增殖,在不加诱导剂的情况下可以诱导MSCs表达矿化相关的基因和蛋白。     

类固醇糖尿病相关致病因素的研究进展

类固醇糖尿病（steroid-induced diabetes mellitus,SDM）是一种继发性糖尿病,其发病主要与肾上腺皮质的糖皮质激素异常分泌或应用过量的外源性糖皮质激素有关,类似于2型糖尿病,SDM的主要致病机制包括胰岛β细胞功能障碍和胰岛素抵抗（insulin resistance, IR）。SDM具有明显的流行病学特征,发病率因致病因素的差异而不同,其引起的血糖水平升高有可逆性。了解其发病机制和相应的致病因素,对预防SDM的发生和对症高效治疗SDM均有十分重要的意义。     

3D生物打印技术在组织工程和器官移植中应用的研究进展

3D生物打印是一种利用计算机三维数字成像技术和多层级连续打印的特点,以活细胞为原料打印活体组织的技术,能够制作出高精度且更为适合人体的模型和组织器官。目前,3D生物打印已在组织损伤修复和器官移植等领域取得了一定的成果,被应用于皮肤、人造血管、牙齿、心脏组织和骨质结构的再生与重建。本文阐述了3D生物打印技术的基本原理,总结了组织工程中3D生物打印的常用方法,概括了目前3D生物打印技术在组织和器官修复中的研究进展。     

沉默CD276 基因促进宫颈癌Caski 细胞的凋亡及作用机制研究

目的:探究免疫共刺激分子CD276在宫颈癌细胞(Caski、Hela)和人源胚胎肾细胞(293T)中的表达量,以及靶向沉默CD276基因来研究CD276对宫颈癌Caski细胞增殖、凋亡影响以及作用机制。方法:荧光定量PCR(RT-PCR)和免疫印迹试验(Western blot)检测CD276在293T、Caski、Hela细胞的表达情况。通过脂质体Lipofectamine 2000体外转染controlsiRNA和CD276 siRNA至宫颈癌Caski细胞中,实验分为对照组、空转染组、CD276 siRNA组,采用Western blot检测Caski细胞中CD276蛋白的表达量。用细胞计数法(CCK-8)、膜联蛋白V-FITC(Annexin V-FITC)碘化丙啶(PI)双染法检测Caski细胞的增殖、凋亡,酶联免疫吸附法(ELISA)测定细胞培养液上清中IL-8、血管内皮生长因子(VEGF)的蛋白水平。结果:免疫共刺激分子CD276在Caski、Hela细胞中的表达量显著高于293T细胞(0. 754±0. 068 vs 0. 261±0. 032; 0. 852±0. 087 vs 0. 279±0. 026; P0. 05); Caski细胞中的表达量显著高于Hela细胞(P0. 05)。与对照组相比,CD276 siRNA组细胞中CD276蛋白的表达量明显降低(0. 235±0. 028 vs 0. 863±0. 091,P0. 05),显著抑制细胞的增殖(0. 326±0. 035 vs 0. 659±0. 068,P0. 05),诱导其凋亡[(23. 487±2. 579)%vs (5. 489±0. 632)%,P0. 05],下调IL-8(43. 257±3. 612 vs 125. 369±18. 478)、VEGF(136. 751±13. 269 vs 369. 254±28. 157)的蛋白水平(P0. 05)。结论:CD276在宫颈癌细胞中的表达量显著增加,沉默CD276基因的表达,明显抑制Caski细胞的增殖,促进其凋亡,其作用与IL-8、VEGF的蛋白水平有关。     

木葡聚糖基温敏水凝胶预防大鼠腹壁-肠壁再粘连及其对局部TGF-β1和CTGF表达的影响

目的：评价木葡聚糖基（mXG）温敏水凝胶对L929鼠成纤维细胞的抗黏附性能,建立粘连松解术后再次粘连动物模型,探讨mXG温敏水凝胶对粘连松解术后再次粘连的预防作用及对转化生长因子β1（TGF-β1）和结缔组织生长因子（CTGF）表达的影响。方法：将L929鼠成纤维细胞接种于mXG温敏水凝胶表面,荧光显色检测其在凝胶表面的黏附性能。制备粘连松解术后再次粘连大鼠模型。48只SD大鼠二次损伤完成后随机分成3组,分别为再粘连组,将1 mL生理盐水注射于大鼠腹壁和盲肠的创面;商业膜组,将2 cm×3 cm大小的壳聚糖防粘连膜覆盖于腹壁创面;mXG温敏水凝胶组,将1mL4% mXG温敏水凝胶注射至腹壁和盲肠的创面,待水凝胶完全形成（3 min）后关腹;每组16只。二次术后第7和14天,每组分别处死8只大鼠,对粘连程度进行评分及组织学观察,免疫组织化学法观察TGF-β1和CTGF表达水平。结果：对照组可见大量L929鼠成纤维细胞贴壁生长,呈细长的梭形并有伪足的形成;mXG温敏水凝胶组在凝胶表面仅有非常少的L929鼠成纤维细胞,呈圆球状。一次术后所有大鼠均形成了可用钝器分开的粘连区。二次术后第7天,再粘连组形成了4~5分粘连,纤维结缔组织大量增生;商业膜组大部分为中度粘连,纤维结缔组织增生较多;mXG组大部分大鼠未见粘连发生且盲肠及腹壁开始愈合,有少量纤维结缔组织增生。术后第14天,再粘连组大鼠腹腔粘连严重,纤维结缔组织及胶原大量增生;商业膜组形成了接近再粘连组的严重粘连;mXG组有2只大鼠发生轻微粘连,其余均未发生粘连,并且盲肠及腹壁创面恢复良好。术后第7和14天mXG水凝胶组大鼠平均粘连评分明显低于再粘连组和商业膜组（P<0.05）。免疫组织化学染色,TGF-β1和CTGF表达水平随大鼠腹膜粘连评分和胶原沉积升高而升高,在再粘连组表达最高,在mXG温敏水凝胶组表达最低。结论：mXG温敏水凝胶具有优异的抗成纤维细胞黏附性能,可以有效预防粘连松解术后再次粘连的发生,并可减少粘连相关因子TGF-β1和CTGF的表达水平。     

PVA/ι-CA软骨组织工程支架对ATDC-5细胞生物学行为和组织相容性的影响

目的：探讨PVA/ι-CA软骨组织工程支架对ATDC-5细胞生物学行为的影响,评价其用于构建组织工程软骨的可行性。方法：采用物理共混技术和反复冷冻-解冻方法,将聚乙烯醇（PVA）和卡拉胶按照一定比例制作成复合支架材料PVA/ι-CA并测定其孔径和孔隙率。将ATDC-5细胞接种于支架材料,观察细胞的黏附生长情况;免疫组织化学法和免疫荧光法检测ATDC-5细胞中Ⅱ型胶原的表达情况;甲苯胺蓝检测ATDC-5细胞形态表现;扫描电镜（SEM）下观察细胞生长及细胞外基质（ECM）分泌情况。将ATDC-5细胞分为阴性对照组（加入空白培养液）和实验组（加入含材料的培养液）,MTT法检测支架材料上2组ATDC-5细胞的增殖率。将支架材料植入SD大鼠皮下,评价该支架材料的组织相容性和血管化能力。结果：PVA/ι-CA软骨组织工程支架平均孔隙率为（86.88±3.88）%,平均孔径为20~40 μm。HE染色,ATDC-5细胞在支架材料上贴附生长良好,呈多角形,形态饱满;免疫组织化学和免疫荧光染色,ATDC-5细胞分泌Ⅱ型胶原蛋白;甲苯胺蓝染色,ATDC-5细胞在支架材料上保持软骨细胞的特性,随着培养时间的延长,支架材料上阳性细胞数量明显增加;ATDC-5细胞与支架材料共培养7 d时,SEM下可见少量细胞呈多角形;培养14 d时细胞数量增多,形态饱满、相互融合,伸入材料间形成锚状结构,牢固地黏附于材料表面;培养21~28 d时材料上附着的细胞分泌大量的ECM包裹材料;ATDC-5细胞在材料上于7~14 d增殖较快,21~28 d增殖较慢,实验组增殖率与对照组比较差异无统计学意义（P>0.05）。皮下包埋早期有轻微的炎症反应,随着时间延长而消退;后期有血管化发生,材料降解吸收比较缓慢。结论：PVA/ι-CA支架材料有望成为的软骨组织工程支架材料。     

腹壁-盲肠损伤粘连模型的建立及mXG温敏水凝胶的防粘连机制研究

  目的  构建腹壁-盲肠损伤粘连模型并探究改性木葡聚糖(mXG)温敏水凝胶对腹壁-盲肠损伤粘连的防治效果。  方法  选用SD大鼠构建腹壁-盲肠损伤粘连模型,随机分为空白对照组(Control)、商业化壳聚糖膜对照组(Film)和mXG温敏凝胶组(Hydrogel),每组16只。Hydrogel组,将1 mL 4%(m/V)mXG溶液涂抹至腹壁和盲肠的创面,待凝胶形成(3 min)后关腹;Film组,关腹前将2 cm×3 cm大小的壳聚糖防粘连膜覆盖于腹壁创面;Control组,关腹前将1 mL生理盐水注射于腹壁和盲肠的创面。术后7 d和14 d,开腹检查腹壁与盲肠的粘连情况,采用双盲设计进行粘连评分。取同一部位粘连组织或创面组织,进行HE、Masson和Van Gieson染色后,进行防粘连效果组织学评价,免疫组织化学染色检测转化生长因子-β1(TGF-β1)和结缔组织生长因子(CTGF)的表达情况。另取12只SD大鼠予以造模和mXG温敏水凝胶干预,术后第1周和6周取心、肝、脾、肺、肾等主要脏器使用HE染色进行组织学检查,进行体内毒性评价。  结果  动物模型大体观察发现,Hydrogel组的大鼠基本未发生粘连,Film组发生轻度粘连,Control组发生了严重的粘连,差异有统计学意义(P < 0.05)。组织学镜下观察发现,7 d时Hydrogel组创面恢复良好,未看到变异的组织,有一定程度的炎性细胞浸润;14 d时创面组织中的炎性细胞明显减少,新生间皮层下仅含有少量胶原纤维的愈合组织;而7 d、14 d,其余两组均出现不同程度粘连的病理表现。免疫组织化学染色发现,Hydrogel组TGF-β1和CTGF的阳性表达一致且较其它两组弱,差异有统计学意义(P < 0.05)。体内毒性检测发现,使用mXG凝胶的动物在不同时间点各脏器的结构均没有出现明显变化。  结论  mXG温敏水凝胶能够在粘连形成的关键时期起到良好的物理隔离作用,有效预防盲肠-腹壁粘连的发生。