视网膜特异性表达人血管内皮生长因子 基因载体的构建

目的构建在视网膜组织特异性表达的人血管内皮生长因子（VEGF）₁₆₅基因。方法用聚合酶链反应(PCR)方法从BLAB/C鼠全基因组扩增能在视网膜组织特异性表达的rho启动子，经限制性内切酶纯化后克隆于质粒pcDNA^3.1+-VEGF₁₆₅中，建立重组质粒pcDNA^3.1+-rho-VEGF₁₆₅，通过限制性内切酶酶切分析及PCR鉴定筛选出正确重组质粒pcDNA^3.1+-rho-VEGF₁₆₅,由jetPEI介导转染人视网膜色素上皮细胞和人脐静脉内皮细胞，并通过免疫组织化学染色以及绘制细胞生长曲线检测在人视网膜色素上皮细胞和人脐静脉内皮细胞中VEGF蛋白的表达。结果在人视网膜色素上皮细胞中，重组质粒pcDNA^3.1+-rho-VEGF₁₆₅比质粒pcDNA^3.1+-rho-VEGF₁₆₅的VEGF蛋白表达强，在人脐静脉内皮细胞，两者的表达量无明显差别。结论pcDNA^3.1+-rho-VEGF₁₆₅载体的构建为进一步研究VEGF在视网膜新生血管形成中的致病机理提供基础材料，并为进一步建立视网膜特异性表达VEGF转基因鼠模型建立了基础。(中华眼底病杂志,2005,21:106-109)     

Glycogen synthase kinase-3: a key kinase in retinal neuron apoptosis in early diabetic retinopathy

Background Diabetes-related pathogenic factors can cause retinal ganglion cell （RGC） apoptosis, but the specific mechanism is not very clear. The aim of this study is to investigate the correlation between glycogen synthase kinase-3 （GSK-3） activation and retinal neuron apoptosis. Methods In an in vitro experiment, the number of apoptotic RGC-5 cells differentiated by staurosporine was evaluated via flow cytometry and nuclei staining using Hoechst 33258. GSK-3 phosphorylation and caspase-3 activation in RGC-5 cells after serum deprivation were determined using Western blotting. Mitochondrial membrane potential was detected using the dye 5,5＇,6,6＇-tetrachloro-l,l＇,3,3＇-tetrethyl benzimidalyl carbocyanine iodide, and reactive oxygen species （ROS） levels were measured with dihydroethidium. In an in vivo experiment, the number of apoptotic retinal neurons was evaluated via terminal transferase dUTP nick-end labeling （TUNEL）, and GSK-3 phosphorylation was determined using Western blotting, in the retinal nerve epithelial tissue of rats in which diabetes was induced by intravenous tail-vein injection of streptozotocin for 4 weeks. Results The levels of phosphorylated Ser21/9 in GSK-3α/13 and p-T308/S473-AKT were lower and the cleaved caspase-3 levels were higher in the serum-deprived model （P 〈0.05）. Lithium chloride treatment was associated with a slower rate of apoptosis, increased mitochondrial membrane potential, and decreased ROS levels in differentiated RGC-5 cells （P 〈0.05）. The level of blood glucose and the number of TUNEL-positive cells in the whole-mounted retinas were higher （P 〈0.01）, and the levels of phosphorylated Ser21/9 in GSK-3α/13 and body weight were lower （P 〈0.05）. However, the thickness of the retinal nerve epithelial layer was not significantly less in diabetic rats compared with control group. Lithium chloride intravitreal injection increased the levels of phosphorylated Ser21/9 in GSK-3α/13 and decreased TUNEL-positive cells in the whole-moun     

P38丝裂素活化蛋白激酶信号通路阻断对糖尿病鼠早期血视网膜屏障和视网膜节细胞的保护作用

目的　观察阻断p38丝裂素活化蛋白激酶(MAPK)信号通路对糖尿病早期Wistar大鼠血视网膜屏障（BRB）和视网膜节细胞（RGC）的保护作用。方法　将60只大鼠分为正常对照组及糖尿病组,每组各30只大鼠。对糖尿病组大鼠进行链脲佐菌素腹腔注射建立糖尿病模型,血糖值＞16.7 mmol/L为模型建立成功的判断标准。正常对照组大鼠腹腔注射等量的枸橼酸钠溶液作为对照。采用IgG渗漏法量化BRB功能破坏和血管渗漏,免疫组织化学法检测视网膜上caspase-3和 血管内皮生长因子（VEGF）的荧光表达。糖尿病鼠建模后2周,对实验组行玻璃体腔注射p38 MAPK抑制剂 SB203580,注射后6周检测caspase-3和 VEGF的荧光表达,caspase-3免疫荧光染色法计数RGC凋亡数量。采用SPSS 13.0应用软件进行统计分析。结果　正常对照组大鼠中,IgG 染色局限于血管腔内,几乎没有渗漏的迹象。糖尿病鼠建模后8周,IgG渗漏明显增加。SB203580璃体腔注射6周后的糖尿病鼠IgG 渗漏减少明显。荧光免疫组织化学及相对定量分析结果显示,SB203580玻璃体腔注射6周后的糖尿病鼠视网膜上VEGF荧光表达呈下降趋势,VEGF相对荧光量从糖尿病鼠8周时较正常对照组高2.9倍减少到仅高于正常对照组1.8倍,两者比较差异有统计学意义（t＝5.203,P＜0.01）。caspase-3免疫荧光染色法RGC凋亡计数结果显示,SB203580玻璃体腔注射6周后,caspase-3阳性节细胞凋亡数与未注射SB203580相比明显减少,两者差异有统计学意义（t＝5.731,P＜0.01）。结论　p38 MAPK抑制剂 SB203580能够减轻糖尿病早期血视网膜屏障的破坏和视网膜节细胞的调亡,提示p38 MAPK信号通路在糖尿病早期对DR的发展起着一定的作用。      

玻璃体腔注射Avastin在晚期增生性糖尿病视网膜病变术中应用分析

目的 探讨玻璃体腔注射Avsstin对晚期增生性糖尿病视网膜病变手术难度的改善、术中眼内填充的选择、手术并发症的发生及疗效情况.方法 2008年7至12月,对晚期增生性糖尿病视网膜病变的病人38例38只眼术前先行玻璃体腔注射Avastin0.06ml(注射组),然后行手术治疗.选择2008年1至6月未进行玻璃体腔注射Avastin的晚期增生性糖尿病视网膜病变的病人47例47只眼作对照(非注射组).观察:(1)注射组与非注射组患者手术中出血情况,医源性裂孔发生率及增殖膜剥除的彻底性;(2)术中需要行硅油填充的比例;(3)术后再出血、再增殖等的发生情况;(4)手术后病人的视力.结果 注射组较大量出血2只眼,5.3%;非注射组20只眼,42.6%(P<0.05).注射组医源性裂孔3只眼,6.4%;非注射组12只眼,25.5%(P<0.05).注射组增殖膜都能彻底剥除,非注射组4只眼进行膜分割,有膜蒂残留.注射组术中2只眼需要硅油填充,5.3%,非注射组11只眼需要硅油填充,23.4%(P<0.05 ).注射组术后有1只眼出现Ⅲ级玻璃体反应,非注射组有4只眼.随访期内,注射组没有再出血的病例,非注射组再出血6只眼,12.8%.注射组术后没有再增殖的病例,非注射组有2只眼因再增殖需再次手术治疗.术后视力注射组为光感至0.2,非注射组为光感至0.1,两组间差异没有统计学意义,但注射组和非注射组术前术后视力均有统计学差异,其P值分别为0.043和0.046.结论 在晚期增生性糖尿病视网膜病变手术前玻璃体腔注射Avastin,能有效控制手术中的出血、膜剥离不彻底、医源性裂孔等并发症的发生,减少硅油填充的比例,减少术后玻璃体冉出血及增殖,大大降低了手术的风险,提高了手术的成功率.     

Avastin在增生型糖尿病视网膜病变手术中的应用及作用机制

背景研究表明avastin辅助玻璃体手术治疗严重增生型糖尿病视网膜病变（PDR）能减少手术并发症,降低手术难度,可能与avastin抑制新生血管的形成有关,但缺乏组织病理学证据。目的探讨玻璃体腔注射avastin辅助的玻璃体手术治疗严重PDR减少手术并发症的可能机制。方法病例对照研究。收集严重PDR患者24例24眼,按照手术方式将患者分为单纯手术组10例10眼,单纯进行玻璃体切割术;avastin＋手术组14例14眼,行玻璃体手术前2周一次性玻璃体腔注射25g/L avastin0．06ml。收集术中剥离的视网膜前膜行苏木精一伊红染色,观察组织病理学改变。应用免疫组织化学染色法检测CD34在新生血管内皮细胞中的表达,比较2组患者视网膜前膜新生血管的密度及单细胞新生血管密度。结果单纯手术组与avastin＋手术组患者的人口基线特征和眼部基线特衙比较差异均无统计学意义（P〉0．05）。单纯手术组视网膜＋＋＋级新生血管者10眼,avastin＋手术组为1眼,二者比较差异有统计学意义（P〈0．01）。组织病理学结果表明,单纯手术组增生膜内可见较多散在的毛细血管型新生血管,多数由单个血管内皮细胞构成管腔,部分区域可见较多出血;avastin＋手术组增生膜玻璃样变的成分增多,新生的毛细血管明显减少或消失。免疫组织化学检测证实,新生血管内皮细胞中CD34均呈强阳性表达,avastin＋手术组400倍镜下每个视野新生血管密度为（15．40±7．42）个,单纯手术组为（8．00±3．80）个,差异有统计学意义（Z=-4．102,P〈0．01）;avastin＋手术组单细胞新生血管密度为（1．88±1．71）个,单纯手术组为（0．45±0．56）个,差异有统计学意义（Z=-4．137,P〈0．01）。结论Avastin可抑制增生膜新生血管芽的形成,阻断新生血管的发生,减轻视网膜水肿,这可能是其辅助玻璃体手术治疗晚期PDR、降低手术难度的主要机制。     

动静脉鞘膜切开术治疗视网膜分支静脉阻塞

目的　观察动静脉鞘膜切开术 (arteriovenoussheathotomy)治疗视网膜分支静脉阻塞 (branchretinalveinocclusion ,BRVO)的临床疗效。方法　分析 1 9例行动静脉鞘膜切开术患者的术中所见 ,术前术后的视力、眼底彩照、眼底荧光造影 (fundusfluoresceinangiography,FFA)、光学相干断层扫描 (opticalcoherencetomography,OCT)、多焦视网膜电图 (multifocalelectroretinography ,mERG)等检查的临床资料。结果　术中 ,动静脉鞘膜切开后均可见近端视网膜静脉充盈增加。随访期间术前确诊BRVO的患者有 5例 (5 /1 0 )视力提高 ,术前为玻璃体出血的患者术后有8(8/9)例视力提高。眼底彩照、FFA发现视网膜出血明显吸收 ,血管变直 ,但有新的无灌注区出现。OCT显示黄斑水肿较术前明显减轻或消失。mERG显示黄斑区反应振幅明显高于术前。 1例患者因反复玻璃体出血再行手术。2例患者因视网膜脱离行硅油填充。 2例患者出现黄斑前膜。结论　动静脉鞘膜切开术是安全有效的手术 ,但仍不是彻底的病因治疗。     

视网膜特异性Rho启动子的基因克隆与序列分析

目的:获取视网膜特异性表达Rho启动子基因,为实现外源基因在视网膜组织中特异性表达做准备。方法:用酚氯仿异戊醇抽提BLAB/c鼠全基因组DNA;设计引物,从基因组中通过PCR扩增获得视网膜特异性表达的Rho启动子基因;克隆入PcDNA3.1 载体,酶切、PCR鉴定,上海博亚生物技术公司测序;序列分析。结果:从BLAB/c鼠全基因组DNA中PCR扩增得到预期大小的启动子片段;构建重组PcDNA3.1 -Rho载体具有与目标片段长度相符的插入片段,插入方向正确;测序结果分析显示,视网膜特异性Rho启动子高度保守,所获得的BLAB/c鼠Rho启动子与Genebank报道的序列一致。结论:成功获得BLAB/c鼠Rho视网膜特异性启动子,为下一步研究视网膜疾病的发病机制和基因治疗奠定了一定的工作基础。     

LASIK术后视网膜脱离的治疗

目的 探讨Lasik术后视网膜脱离及其治疗的特点。方法 分析了10例11只眼Lasik术后视网膜脱离的患者的特点、手术方式、术后并发症等。结果 11只眼中,周边多发性视网膜裂孔8只眼（72.73%）,巨大裂孔3只眼（27.27%）。所有患者均行环扎术,其中3例行玻璃体切割术和硅油填充术。1例术后出现角膜瓣翻转,1例术后出现了角膜瓣下混浊。结论 Lasik术后的视网膜脱离,以周边多发性视网膜裂孔多见,巨大裂孔发生率高;手术方式首选巩膜扣带术。在诊治中要注意保护角膜,避免出现角膜的并发症。Lasik术后复查应常规散瞳检查眼底。高度近视患者要慎行Lasik术。     

增殖性糖尿病视网膜病变玻璃体SDF-1和VEGF的含量分析

研究增殖性糖尿病视网膜病变患者玻璃体基质细胞衍生因子（Stromalcell—derivedfactor-1。SDF-1）和血管内皮生长因子（Vascularendothelialgrowthfactor，VEGF）的浓度，及其相互作用关系。方法：酶联免疫吸附法（Enzyme-linkedimmunosorbentassay，ELISA）检测玻璃体内SDF-1和VEGF的含量，每个标本重复3次。实验组为增殖性糖尿病视网膜病变（Proliferativediabeticretinopathy，PDR）的住院患者30例，对照组为同期行玻璃体切除术的特发性黄斑裂孔患者12例。结果：PDR患者玻璃体VEGF的平均浓度为（2865．87±387．85）pg／ml，明显高于特发性黄斑裂孔组[（142．42±21．03）pg／ml，P〈0．0001]。增殖性糖尿病视网膜病变患者玻璃体SDF-1的含量平均为（298．40±24．57）pg／ml，对照组为（86．9l±15．89）pg／ml，两组的差异具有统计学意义（P〈0．0001）。在30例PDR患者玻璃体内VEGF和SDF-1的含量表现为正相关（Pearson相关系数r=0．62，P〈0．001）。结论：增殖性糖尿病患者玻璃体SDF-1和VEGF的含量均高于非糖尿病患者，提示SDF-1和VEGF共同参与了增殖性糖尿病视网膜病变患者病理性新生血管的形成过程。     

视乳头切开治疗视网膜中央静脉阻塞

目的　观察视乳头切开术 (radialopticneurotomy)治疗视网膜中央静脉阻塞 (centralretinalveinocclu sion ,CRVO)的临床疗效。方法　分析 1 0例行视乳头切开术的患者的术中所见 ,术前术后的视力、眼底彩照、眼底荧光造影 (fundusfluoresceinangiography ,FFA)、光学相干断层扫描 (opticalcoherencetomography ,OCT)、多焦视网膜电图 (multifocalelectroretinography ,mERG)等检查的临床资料。结果　术中 ,视乳头切开后均可见视盘近端视网膜静脉充盈增加。随访期间 7例视力提高 ,1例保持不变 ,2例下降。眼底彩照、FFA发现视网膜出血明显吸收 ,血管变直 ,但有新的无灌注区出现。OCT显示黄斑水肿较术前明显减轻或消失。mERG显示黄斑区反应振幅变化不大。1例患者因严重视网膜下出血行硅油填充术。 1例患者出现黄斑前膜。结论　视乳头切开术是安全有效的手术。但仍不是彻底的病因治疗