PKCι对CIK杀伤胰腺癌细胞的影响及作用机制探讨

  目的  研究非典型蛋白激酶C异构体ι(protein kinase C,PKCι)对细胞因子诱导的杀伤细胞(cytokine-induced killer cell,CIK)作用于胰腺癌细胞的杀伤作用的影响,并探讨其作用机制。  方法  用白介素-2(IL-2)、干扰素(IFN)、分化抗原簇三分子单克隆抗体(CD3 mAb)等细胞因子诱导健康人外周血中单个核细胞,制备成CIK细胞。将胰腺癌细胞MiaPaCa、PANC-1和胰腺上皮细胞HPDE6-C7分为对照组、化学抑制剂硫代苹果酸钠(ATM组)、与CIK共培养组、ATM+CIK共培养组。采用细胞计数检测各组细胞1~8 d的生长情况;各组细胞培养48 h后采用流式仪检测细胞死亡率;使用针对人PKCι的小发夹RNA(small hairpin RNA,shRNA)敲低胰腺癌细胞中PKCι的表达,胰腺细胞转染过表达PKCι的重组质粒,分别采用免疫印迹检测PKCι蛋白表达和实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测PKCι对下游信号分子中转化生长因子-β(transforming growth factor-β,TGF-β)基因表达的影响;并在MiaPaCa和PANC-1与CIK共培养中加入不同质量浓度TGF-β(1、10、20 ng/mL),48 h后流式仪检测细胞死亡情况,以探讨PKCι影响CIK细胞杀伤活性的相关机制。  结果  ATM和CIK可抑制胰腺癌细胞MiaPaCa、PANC-1的生长,诱导癌细胞凋亡和死亡,ATM可增强CIK对癌细胞的杀伤作用。敲低胰腺癌细胞中PKCι的表达,可下调其下游信号分子TGF-β基因的表达,而胰腺细胞过表达PKCι,可上调TGF-β mRNA表达,并且在胰腺癌细胞中加入TGF-β 10、20 ng/mL,癌细胞的死亡率较对照组下降(P < 0.05)。  结论  降低胰腺癌细胞中PKCι的表达可以抑制胰腺癌细胞的生长,增强CIK对癌细胞的杀伤作用。PKCι的作用机制可能是通过调控TGF-β水平影响肿瘤细胞的免疫逃逸。     

PKCι对维持KRAS突变结肠癌生存的作用及机制

目的 探讨PKCι在维持KRAS突变结肠癌生存中的作用及相关分子机制。方法 选取携KRAS突变的HCT116细胞和不携KRAS突变的RKO细胞为研究材料，两种细胞分别设置空白对照组（Control组）、ATM抑制组、shRNA-prkci组及shRNA-kras组。流式细胞术检测结肠癌细胞的凋亡及增殖情况。免疫印迹法(Western blot)和实时荧光定量PCR（qRT-PCR）检测KRAS、YAP1、PKCι的相对表达量。免疫荧光实验检测YAP1的表达。结果 在携KRAS突变的HCT116细胞中，PKCι的抑制伴随着细胞凋亡和生长抑制(均P＜0.05)；并且抑制PKCι可显著下调HCT116中YAP1的表达。而在不携带KRAS突变的RKO细胞中这种效应不明显。结论 PKCι通过调控YAP1维持KRAS突变结肠癌生存。PKCι与YAP1为潜在的结肠癌治疗靶标。     

添加RGD短肽的新型培养基对细胞生长、融合及外源基因表达的影响

目的在普通培养基中添加RGD短肽制备新型培养基,观察新型培养基对细胞生长状态、杂交瘤细胞融合和外源基因表达的影响。方法以普通培养基为对照,在普通培养基中添加不同质量浓度的RGD制备新型培养基,通过观察人胰腺上皮细胞株HPDE6-C7的生长增殖情况确定RGD的最佳质量浓度,然后,在培养基中接种不同浓度（5×104、105、5×105 mL－1）的HPDE6-C7细胞,通过倒置显微镜观察细胞的形态、贴壁、长势和密度情况;再分别用普通培养基和添加RGD短肽的新型培养基进行杂交瘤细胞的融合,比较两种培养基融合后克隆形成率和克隆阳性率的差异;通过转染含绿色荧光蛋白(GFP)的质粒观察其荧光强度的方法和转染过表达KRAS质粒观察其蛋白表达的方法,观察添加RGD短肽的新型培养基相比普通培养基在转染外源基因表达水平方面的优势。结果RGD短肽使用的最佳质量浓度为10 ng/mL;添加RGD短肽的新型培养基所培养的细胞相比普通培养基形态更佳、贴壁更好、增殖更快。同时,添加RGD短肽的新型培养基应用于细胞融合所形成克隆的百分率和克隆阳性率均高于普通培养基（PGFP后荧光强度更高（PKRAS的蛋白水平也更高（P<0.05）。结论添加RGD短肽的新型培养基在细胞生长状态、杂交瘤细胞融合及外源基因表达方面有突出优势,RGD短肽应用于细胞培养可能具有广泛前景和潜在的价值。