原核细胞阳性克隆的筛选

基因重组的连接反应物通过转化产生大量转化菌 ,只有通过高敏感和高特异的筛选方法才能挑选和鉴定出含有正确目的基因的重组体。此类方法的基本原理基于 :① 196 7年 ,Ullmann等发现大肠杆菌带有完整的近操纵基因区段 β D半乳糖甘酶阴性的突变体和LacZ基因上缺失近操纵基因区段的突变体之间互补 ,实现对 5 溴 4 氯 3 吲哚 β D半乳糖(X gal)分解显色形成蓝色菌落 ;② 1975年 ,Grun stein和Hogness介绍一种在硝酸纤维素膜上原位裂解细菌菌落并释放DNA非共价结合于滤膜的方法 ,结合于滤膜的DNA可与相应的放射性标记的核酸探针进行杂…     

VitE对动脉粥样硬化模型兔肝脏肌球蛋白轻链激酶活性及表达的影响

目的　探讨维生素E(VitE)对动脉粥样硬化模型兔肝脏MLCK活性及表达的影响。方法　复制兔动脉粥样硬化模型 ,用γ 3 2 P参入法检测肝脏MLCK活性 ,免疫荧光法检测肝组织MLCK的表达。结果　动脉粥样硬化兔模型建立成功 ,在喂胆固醇 4wk及 12wk的动物组 ,肝脏MLCK活性[分别为 (1884 8 7± 74 34 3)、(18818 3± 346 9 9)cpm·mg-1protein]与正常对照比较 [(6 6 77 5± 10 9 6 0 )cpm·mg-1pro tein]升高 (P <0 0 5 ) ;但在喂胆固醇同时添加VitE后 ,肝脏MLCK活性 [(10 898 8± 2 0 4 1 2 )cpm·mg-1protein]与正常对照组比较升高不明显 (P >0 0 5 )。荧光显微镜下观察显示 ,兔肝在喂食胆固醇膳食 4wk后MLCK的表达有所增强 ,12wk后显著增强 ,12wk组的膳食中同时加VitE后 ,MLCK表达有所下降。结论　在动脉粥样硬化过程中 ,肝脏病变可能与MLCK活性增强有关 ,VitE可能是降低肝脏MLCK活性的因素 ,同时防止肝细胞的损伤     

胰岛素对糖尿病模型大鼠肾脏肌球蛋白轻链激酶表达的影响

已知糖尿病早期肾小球滤过率(GFR)升高,并与糖尿病肾病的发展有关[1,2].肾小动脉血管平滑肌的收缩改变了肾血流动力学是引起GFR升高的原因之一.探索糖尿病肾血管平滑肌收缩的调控因素可为进一步阐明糖尿病发生发展机制打下良好的基础.肌球蛋白轻链激酶(MLCK)表达增加和活性升高是血管平滑肌收缩的启动因素之一[3].糖尿病个体是否存在MLCK表达的变化尚未见报道.本研究在复制大鼠糖尿病模型的基础上,观察胰岛素对糖尿病大鼠肾MLCK表达的影响.     

miR-29c通过调控SIRT1表达介导动脉粥样硬化氧化应激与炎症反应

目的研究miR-29c能否通过调控沉默信息调节因子2相关酶类1(SIRT1)的表达影响动脉粥样硬化(AS)进程中氧化应激及炎症反应。方法采用ApoE^-/-基因敲除小鼠(ApoE^-/-),经适应性饲养,于6周龄时以高脂饲料喂养,构建AS模型(AS组);以C57BL/6J小鼠为正常对照组,给予普通饲料喂养。12周后取主动脉,检测miR-29c表达以及肿瘤坏死因子-α(TNF-α)mRNA水平、活性氧(ROS)、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)氧化酶水平。培养人脐静脉内皮细胞(HUVEC),分别转染miR-29c mimic和antagomir,以氧化型低密度脂蛋白(oxLDL)(50μg/ml)进行刺激,检测各组TNF-α表达、ROS、NADPH氧化酶水平。此外,实时PCR和Western blot检测oxLDL诱导的内皮细胞损伤模型中SIRT1 mRNA及蛋白表达水平变化,并进一步检测正常细胞转染miR-29c mimic与antagomir后SIRT1 mRNA及蛋白表达水平。结果与正常组比较,AS组miR-29c表达及TNF-αmRN...     

褪黑素通过 ERK/MAPK 通路调控 AS 兔动脉内皮细胞 MLCK 表达

 目的 探讨褪黑素（ melatonin , MLT ）是否可通过信号调节激酶 / 丝裂原活化蛋白激酶（ ERK/MAPK ）通路调控动脉粥样硬化（ atherosclerosis , AS ）模型兔动脉内皮细胞肌球蛋白轻链激酶（ myosin light chain kinase , MLCK ）的表达。 方法 复制兔 AS 模型,分析血清中相关脂质成分的动态变化;γ -³²P-ATP 掺入法测定模型兔主动脉的 MLCK 活性;动脉经冰冻切片,免疫组化检测动脉内膜 MLCK 的表达,伊红（ HE ）染色观察动脉壁的形态结构; Western blot 检测 AS 兔动脉组织 MLCK 的表达和 ERK 磷酸化水平。 结果 AS 兔模型复制成功,实验兔在高胆固醇（ cholesterol , Cho ）饮食 4 , 8 , 12 周后,与正常对照相比,血清中相关生化指标有逐渐增加趋势（ <> P <0.05 ）;γ -³²P-ATP 掺入法显示动脉组织中 MLCK 的活性呈逐渐增强趋势（ <> P <0.05 ）, Western blot 和免疫组化则显示动脉内皮细胞 MLCK 的表达、 ERK 磷酸化水平亦呈逐渐增强趋势, HE 染色显示主动脉内膜逐渐增厚,细胞间隙逐渐增大;而加喂 MLT 后,动脉组织 MLCK 的表达、 ERK 磷酸化水平及 MLCK 的活性和主动脉内膜通透性均有所下降,而泡沫细胞形成量逐渐增多,至高 Cho 饮食 12 周时则形成了明显的 AS 斑块,加喂 MLT 后,主动脉内膜病变则有一定程度减轻。 结论 MLT 可能通过 ERK/MAPK 通路下调模型兔动脉内皮细胞 MLCK 活性而减轻 AS 斑块的病变程度。     

全反式维甲酸对实验性动脉粥样硬化兔动脉平滑肌细胞骨桥蛋白表达的影响

目的 探讨全反式维甲酸(ATRA)对动脉粥样硬化(AS)模型兔动脉骨桥蛋白(OPN)表达的影响.方法 复制AS兔模型,采用免疫组化和Western blot分析主动脉OPN的表达.结果成功建立As兔模型,高脂组兔主动脉OPN蛋白表达水平增加,经ATRA治疗后OPN蛋白表达下降,AS斑块减少.结论 ATRA可能通过降低动脉OPN的表达抑制AS的形成.     

质粒的制备

随着人类基因组计划的顺利进行 ,一个更为广阔且具活力和应用前景的研究领域人类基因组后计划已形成 ,并吸引全世界顶尖科学家和实验室参与。人类基因组后计划的研究内容主要涉及功能基因的分离、鉴定 ,其编码蛋白质的生物学功能及其可应用研究。本领域所采用的研究方法主要包括分子生物学、蛋白质组学和功能蛋白质学等实验方法。其中 ,分子生物学常用实验方法在研究中使用最广 ,可变性最大 ,且可选择最多。为提高我校广大科学研究者对分子生物学技术和实验方法有一较全面的了解和知晓本校可用的资源 ,特邀请本校分子生物学中心试验室根据其研究工作撰写有关分子生物学常用实验方法的介绍 ,并陆续在本刊上发表 ,供大家参考     

人非肌肉肌球蛋白轻链激酶N端表达载体的构建及其在大肠杆菌中的表达

目的：构建人非肌肉肌球蛋白轻链激酶(hnmMLCK)N端表达载体及其体外表达与表达产物的纯化。方法：用PCR方法扩增hnmMLCK的N端cDNA ,插入质粒pBKcmv中的构建成表达载体，转化入大肠杆菌XL1-blue，经IPTG诱导表达，表达产物用电洗脱的方法初步纯化。结果：经限制性内切酶酶切图谱分析和DNA序列测定证明所构建质粒为hnmMLCK重组质粒，SDS－PAGE证实获得分子量为21ku的融合蛋白，表达量约占菌体总蛋白的21％。结论：成功构建了重组hnmMLCK表达载体，并在大肠杆菌中获得表达，为进一步研究及临床应用奠定了良好基础。     

限制性内切酶酶切及限制性内切酶酶切图谱分析

限制性核酸内切酶(restriction endonuclease)是一类能够识别DNA的特异序列并在识别位点剪切双链DNA的核酸内切酶。主要存在于原核生物中，大多数来自于细菌体内，与相伴存在的甲基化酶共同构成细菌的限制一修饰体系，限制外源DNA、保护内源DNA。1970年Smith等分离到第一种限