药物介导小鼠胚胎干细胞体外定向分化为心肌细胞

[目的 ]胚胎干细胞 (embryonicstemcells ,ES细胞 )是从早期胚胎内细胞团或桑椹胚分离出来的全能细胞系 ,具有体外不分化的无限增殖能力 ,当处于适合的培养条件下 ,可定向分化形成多种单一的细胞。本研究利用ES细胞的这种特性 ,旨在构建一种可提供生物信息量大而专一性强的体外药物筛选和安全性评价模型。由于ES细胞体外定向分化模型重演了基因按照特定的时间、空间表达的过程。在与药物共培养的过程中 ,ES细胞定向分化模型提供了药物介导机体生理、病理情况下生命现象的所有生物信息。基于ES细胞具有的全能性 ,用以筛选某种特定作用的药物时 ,在其定向分化为某一特定细胞过程中 ,可采集到核酸层面和蛋白层面的生物信息及其转录、翻译过程中的信号转导和修饰过程。 [方法 ]以小鼠ES细胞作为生物测试载体 ,将ES细胞用胰酶消化后 ,以合适的密度制成单细胞悬液 ,采用悬滴培养方法和特定的药物改变其培养微环境进行分化培养。 [结果 ]按上述方法经过约 13d的培养 ,先后分两批定向分化出 30余个具有自律性搏动的心肌细胞团。其搏动频率有差异 ,范围在 80～ 130次 /min之间 ,各细胞团搏动的节律非常有规则 ,以搏动频率与节律作为评价指标 ,定向分化成功率达 80 %以上。 [结论 ]本研究构建了小鼠ES细胞体外定向     

Rictor对小鼠胚胎干细胞来源心肌细胞线粒体钙信号的调控

目的: 探索Rictor在小鼠胚胎干细胞来源心肌细胞（ESC-CM）中的表达、定位及其对线粒体钙信号的调控作用。方法: 通过经典"悬滴-悬浮-贴壁"三步法建立ESC-CM模型。利用免疫荧光法及蛋白质印迹法观察Rictor在ESC-CM中的定位。慢病毒技术干扰小鼠胚胎干细胞Rictor表达后,采用免疫荧光法考察ESC-CM内质网与线粒体的叠加情况;通过透射电镜观察ESC-CM的超微结构;活细胞工作站测定分化后心肌细胞线粒体钙瞬变;免疫共沉淀法检测ESC-CM中1,4,5-三磷酸肌醇受体（IP3R）、葡萄糖调节蛋白75（Grp75）、线粒体外膜的电压依赖性阴离子通道1（VDAC1）间的相互作用;蛋白质印迹法检测线粒体融合蛋白2（Mfn2）的表达情况。结果: Rictor在ESC-CM中主要定位于内质网及线粒体-内质网结构偶联（MAM）域,且其表达定位与线粒体及内质网有很好的叠加。干扰Rictor后,心肌细胞线粒体部分呈散点状,线粒体与内质网的叠加率降低（P < 0.01）;ESC-CM超微MAM形成减少;ATP刺激引起的ESC-CM线粒体钙瞬变幅度下降,其中钙瞬变斜率和上升峰值均降低（均P < 0.01）;MAM中IP3R、Grp75、VDAC1相互作用明显减弱,且Mfn2蛋白表达降低（P < 0.01）。结论: 干扰小鼠胚胎干细胞中Rictor表达可降低ESC-CM中钙从内质网到线粒体的释放,这可能是通过影响IP3R、Grp75、VDAC1间相互作用,减少Mfn2表达,进而破坏MAM来实现的。     

大学生科研训练计划在药学创新型人才培养中的实施与展望

开展大学生科研训练计划（Student Research Training Program,简称SRTP）,是改革本科生教学模式的重要举措,成为培养和提高学生科研创新能力的有效形式和重要途径。该文介绍浙江大学药学院药理毒理与生化药学研究所心脑血管与肝脏药理研究团队近五年来组织、管理、实施SRTP所开展的工作和取得的成绩,通过带教师生的切身感受,说明SRTP对培养创新型药学人才的作用,并对进一步完善SRTP提出思考与建议。     

ES细胞体外定向分化为睾丸间质样细胞模型的建立

目的:建立小鼠胚胎干(embryonic stem,ES)细胞体外分化为睾丸间质样细胞(leydig-like cells)的模型。方法:采用脂质体转染方法将含类固醇生成因子1(steroidogenic factor 1,SF-1)基因片断的质粒转入小鼠ES-D3细胞,并在RA和8Br-cAMP作用下,体外诱导ES-D3细胞分化为睾丸间质样细胞,以空质粒转染组做阴性对照;通过光镜观察转染SF-1的ES-D3细胞定向分化为睾丸间质样细胞过程中的形态变化;用RT-PCR及Western Blot法检测分化过程中类固醇激素合成急性调节蛋白(StAR),胆固醇侧链裂解酶P450scc(CYP11A1)和3β-羟甾脱氢酶1(3β-HSD1)表达情况;免疫荧光法检测睾丸间质样细胞特异性蛋白P450scc及3β-HSD1表达。结果:ES-D3细胞转染SF-1质粒24 h,即检测到SF-1基因表达。转染成功的ES-D3细胞在RA和8Br-cAMP诱导分化48 h后出现睾丸间质样细胞。分化而来的睾丸间质样细胞胞体大而圆润,长有触角,呈纺锤形;且表达睾丸间质样细胞特异性蛋白P450scc和3β-HSD1,同时StAR表达显著增加,而对照组细胞未表达睾丸间质样细胞特异性标志物StAR、P450scc和3β-HSD1。结论:通过对ES-D3细胞转染SF-1质粒并予以RA和8Br-cAMP诱导,成功建立ES-D3细胞定向分化为睾丸间质样细胞模型。     

淫羊藿苷诱导小鼠胚胎干细胞体外定向分化为心肌细胞方法学研究

 目的采用药物淫羊藿苷(icariin,ICA)改变小鼠胚胎干细胞(embryonic stem cell,ES细胞)体外培养的微环境,建立一种药物介导提高ES细胞体外定向心肌细胞分化率的实验体系。方法采用悬滴培养法,构建ICA诱导ES细胞体外定向分化为心肌细胞的实验评价体系;并利用RT-PCR法和免疫荧光法鉴定心肌细胞。结果ICA在10^-7mol·L^-1浓度时,对ES细胞定向分化为心肌细胞呈现最佳诱导效应,分化率最高达84%(P<0.001)。ES细胞源心肌细胞表达心肌特异性基因肌球蛋白重链(α-MHC)和心室肌球蛋白轻链(MLC-2v),且心肌特异性肌小节α辅肌动蛋白(α-actinin)和肌钙蛋白T(troponin T)呈阳性表达。结论悬滴培养法结合药物改善微环境,可用于药物诱导ES细胞定向分化心肌细胞的实验体系。     

淫羊藿素诱导小鼠胚胎干细胞体外定向分化为神经细胞

目的:采用淫羊藿素(icaritin,ICT)改变小鼠胚胎干细胞(embryonic stem cell,ES细胞)体外培养微环境,论证ICT提高ES细胞体外定向分化为神经细胞的效应。方法:采用拟胚体培养法,评价ICT对ES细胞体外定向分化为神经细胞的诱导作用;并利用RT-PCR法和免疫荧光法鉴定神经细胞特异基因和蛋白表达谱。结果:ICT在10-7mol/L浓度时,对ES细胞定向分化为神经细胞表型呈现最佳诱导效应,在分化d8 8时,分化率高达80%(P<0.001),并呈良好的量效和时效关系。分化神经表型者表达神经元特异性微管蛋白(β-tubulin Ⅲ)基因和神经胶质细胞特异性胶质纤维酸性蛋白(GFAP)基因,同时伴有神经前体细胞特异性标志蛋白(nestin)及β-tubulin Ⅲ和GFAP特异性蛋白阳性表达。结论:应用拟胚体培养微环境调控法,ICT可诱导小鼠ES细胞定向分化为神经细胞,并与神经发育依赖性特异基因和蛋白表达呈正相关。     

心房颤动合并冠心病患者的药学监护

目的探讨心房颤动合并冠心病的药学监护点和规范化的药学监护模式。方法临床药师以1例心房颤动合并冠心病患者的用药为切入点,利用药物相互作用、不良反应等药学知识,参与药物治疗方案的选择,实施药学监护。结果与结论心房颤动合并冠心病患者往往用药较为复杂,临床药师应围绕患者的抗凝方案,关注药物的相互作用,监测药物不良反应,用药教育则应以华法林和冠心病二级预防为主。     

淫羊藿苷诱导小鼠胚胎干细胞体外定向分化为心肌细胞方法学研究

目的 采用药物淫羊藿苷(icariin,ICA)改变小鼠胚胎干细胞(embryonic stem cell,ES细胞)体外培养的微环境,建立一种药物介导提高ES细胞体外定向心肌细胞分化率的实验体系.方法 采用悬滴培养法,构建ICA诱导ES细胞体外定向分化为心肌细胞的实验评价体系;并利用RT-PCR法和免疫荧光法鉴定心肌细胞.结果 ICA在10-7mol&#183;L-1浓度时,对ES细胞定向分化为心肌细胞呈现最佳诱导效应,分化率最高达84%(P＜0.001).ES细胞源心肌细胞表达心肌特异性基因肌球蛋白重链(α-MHC)和心室肌球蛋白轻链(MLC-2v),且心肌特异性肌小节α辅肌动蛋白(α-actinin)和肌钙蛋白T(troponin T)呈阳性表达.结论 悬滴培养法结合药物改善微环境,可用于药物诱导ES细胞定向分化心肌细胞的实验体系.     

环孢素软胶囊原研药与仿制药体外一致性评价

目的 比较国产环孢素软胶囊与进口原研药在4种不同溶出介质中溶出曲线的一致性。方法 以水、0.1 mol·L^-1盐酸、pH 4.5醋酸盐缓冲溶液和pH 6.8磷酸盐缓冲溶液为溶出介质,分别测定其溶出曲线,并采用f₂因子来考察其相似性。结果 国产环孢素软胶囊3批样品在水中的溶出曲线与原研药均存在差异(f₂均<50,f₂平均值为40.20,RSD为2.53%),在0.1 mol·L^-1盐酸,pH 4.5醋酸盐缓冲溶液和pH 6.8磷酸盐缓冲溶液3种介质中的溶出曲线与原研药相似性较高(f₂均>50,f₂平均值分别为61.60,63.56,81.57,RSD分别为2.23%,3.15%,0.45%)。结论 国产环孢素软胶囊在水以外的其他3种介质中的溶出曲线与原研药相似性较高,但在水中的溶出曲线与原研药存在差异,提示两者在工艺上存在差异。