地鼠多瘤病毒PCR检测方法的建立

目的  建立地鼠多瘤病毒（hamster polyomavirus, HaPyV）PCR检测方法,并应用于乙型脑炎减毒活疫苗生产过程中地鼠肾细胞的感染检测。方法  设计针对HaPyV衣壳蛋白VP1基因片段的特异引物,以含HaPyV VP1片段的质粒PMD19T-HaPyV688为模板进行PCR扩增并测序确认扩增产物。以多种病毒DNA为模板进行PCR扩增并对扩增产物进行斑点杂交鉴定以验证PCR方法的特异性。将定量的质粒PMD19T-HaPyV688 10倍系列稀释后进行PCR敏感性检测。以小鼠多瘤病毒(murine polyomavirus, MuPyV)检验PCR法对质粒DNA和病毒DNA检测的一致性。应用建立的方法对生产用地鼠肾细胞悬液进行HaPyV DNA检测。结果  仅含有质粒PMD19T-HaPyV688和MuPyV DNA的样品能够扩增出600 bp的片段,经斑点杂交及测序证明其分别为HaPyV和MuPyV的VP1特异基因片段。PCR所能检出的PMD19T-HaPyV688和MuPyV 的最少DNA拷贝数分别为5300和590。7个亚批生产用地鼠肾细胞悬液的HaPyV检测结果均为阴性。结论  建立的PCR方法具有较高的敏感性和特异性,可用于生产用地鼠肾细胞HaPyV感染的检测。     

重组人干扰素α2b包涵体纯化方法的研究

目的研究重组人干扰素α 2b包涵体的纯化方法。方法超声破碎菌体 ,干扰素α 2b包涵体经洗涤液洗涤后 ,SDS -PAGE检测其纯度 ,VSV -WISH细胞系统测定干扰素活性。结果差速离心很难完全将包涵体和细菌碎片分开。超声破碎 6次和 9次的干扰素α 2b包涵体纯度和活性相近 ,均明显高于 3次超声破碎处理的包涵体。用含2～ 4mol/L尿素、1%TritonX - 10 0的洗涤液对干扰素α 2b包涵体洗涤 ,能提高包涵体纯度。结论建议超声破碎 6次 ,用含 2～ 4mol/L尿素、1%TritonX - 10 0的洗涤液纯化干扰素α 2b包涵体     

肠道病毒71型细胞感染灭活验证方法的建立

目的建立肠道病毒71型细胞感染灭活验证的方法,为肠道病毒71型灭活疫苗的安全性提供技术保障。方法将不同浓度的肠道病毒71型接种于五种不同细胞选择敏感性好的细胞,然后将制备的8批肠道病毒71型灭活样品接种在筛选到的敏感细胞上,35oC,5％CO：连续培养21d,观察细胞病变情况。结果Vero细胞感染法最低能检测到1CCID如／ml的肠道病毒71型,该方法检测8批肠道病毒71型灭活样品均为阴性。结论本研究建立的肠道病毒71型细胞感染灭活验证方法具有良好的敏感性和重复性,可用于肠道病毒71型疫苗的灭活验证。     

登革病毒4型E蛋白的表达与多克隆抗体的制备

 目的 在原核细胞中表达登革病毒4型E蛋白及E蛋白III区,分别以两种蛋白免疫家兔,获得可检测登革病毒的多克隆抗体。方法 将登革病毒4型E蛋白与E蛋白III区编码序列克隆到pET-32a（+）质粒中,分别构建两种蛋白的表达载体,以IPTG诱导其在Rosetta细胞中的大量表达,并进行SDS-PAGE检测。分别以两种蛋白免疫家兔,制备出针对E蛋白与E蛋白III区的多克隆抗体,并对其进行Western blot鉴定。结果 登革病毒4型E蛋白与E蛋白III区在Rosetta细胞中以包涵体的形式大量表达;利用所制备的多克隆抗体对登革病毒进行检测,出现了预期的条带。结论 本研究制备获得的多克隆抗体可用于登革病毒的检测,为登革病毒相关研究奠定了基础。     

无小鼠神经毒力的乙型脑炎病毒/登革病毒1型嵌合病毒的筛选与序列分析

目的  采用蚀斑纯化法筛选对小鼠无神经毒力的乙型脑炎病毒（Japanese encephalitis virus,JEV）/登革病毒（dengue virus,DENV）1型嵌合病毒（JD1）纯化株,分析影响JD1小鼠神经毒力的相关位点。方法  将JD1在乳地鼠肾细胞中进行3轮蚀斑纯化,检测JD1纯化株对小鼠的脑内神经毒力。然后提取无神经毒力纯化株的基因组RNA,用逆转录PCR分段扩增全基因组序列并进行序列测定。将测序结果分别与原DENV-1 的前膜-包膜蛋白和JEV骨架病毒株SA-14-14-2的基因序列进行比对。选取2个无神经毒力纯化株进行小鼠免疫保护实验。采用单侧t检验对结果进行比较。结果  经过3轮蚀斑纯化后,获得大、中、小3种蚀斑形态的6个JD1纯化株。3个纯化株对小鼠无神经毒力,小鼠脑内注射后全部存活;1株神经毒力较弱,70%以上小鼠存活;2株具有强神经毒力,小鼠全部死亡。测序结果显示,对小鼠无神经毒力的3个纯化株存在2处相同的氨基酸突变。将其中2个纯化株JD1-PP-61和JD1-PP-31腹腔免疫小鼠后,再用1 000半数致死量DENV-1鼠脑适应株进行脑内攻击。JD1-PP-61能较好地保护小鼠抵抗病毒攻击,仅20.0%小鼠死亡（t=7.237,P<0.001）;JD1-PP-31保护效果稍弱,41.9 %小鼠死亡（t=4.752,P<0.01）。结论  通过蚀斑纯化筛选出对小鼠无神经毒力的JD1纯化株,并发现了可能与神经毒力减弱相关的位点。     

结核分枝杆菌Rv0901基因原核表达质粒的构建及其表达

目的　为研究结核分枝杆菌基因Rv0 90 1的功能提供材料。方法　PCR扩增Rv0 90 1基因编码序列 ,定向克隆入融合蛋白原核表达载体pGEX 1λT获得重组表达质粒 ,转化大肠杆菌后用IPTG进行诱导表达 ,通过SDS PAGE、GST 纯化试剂盒鉴定并纯化表达产物。结果　从结核杆菌H37Rv株基因组DNA中扩增出Rv0 90 1基因 ;成功构建了融合表达质粒pGEX Rv0 90 1;重组质粒经IPTG诱导后能在大肠杆菌中稳定表达 4 5kDa的GST Rv0 90 1融合蛋白。结论　本实验成功表达并纯化GST Rv0 90 1融合蛋白 ,为Rv0 90 1基因功能的研究打下了基础。     

乙型脑炎疫苗株SA14-14-2包膜蛋白279位氨基酸回复突变对其毒力的影响

目的:探索乙型脑炎病毒(JEV)疫苗株SA14-14-2包膜蛋白279位氨基酸(E279)MK回复突变(M279K)对其毒力的影响。方法:用重叠延伸PCR技术和基因克隆技术构建含有SA14-14-2包膜蛋白M279K突变的全长cDNA质粒pACNR-JEV(M279K),并以其为模板体外转录RNA,将RNA电转染导入BHK21细胞得到恢复病毒rJEV(M279K),并比较恢复病毒和疫苗病毒在蚀斑大小以及对小鼠神经毒力等方面的差别。结果:酶切及测序表明质粒模板成功构建,除人为引入的突变外(碱基1813处T→A),无任何碱基突变,并发现rJEV(M279K)形成比疫苗株更小的蚀斑,但毒力与疫苗株无显著差异。结论:E279回复突变影响乙脑疫苗SA14-14-2病毒蚀斑大小,但并未明显增强疫苗株对小鼠的神经毒力。     

柯萨奇病毒A组16型毒株的分离及其生物学特性初步分析

 目的  对柯萨奇病毒A组16型（coxsackievirus A16,CA16）毒株进行分离、鉴定,并分析其生物学特性,为CA16疫苗候选毒株的筛选奠定基础。方法  从手足口病患者的咽拭子或疱疹液样本中分离CA16毒株,经噬斑纯化后,用逆转录-聚合酶链反应进行病毒鉴定。将病毒连续传代后,对其VP1基因进行序列测定,分析VP1基因和氨基酸序列的同源性和遗传稳定性。结果  通过Vero细胞适应传代和噬斑纯化,获得遗传稳定的CA16毒株,感染Vero细胞后引起典型的细胞病变。病毒分离株经CA16特异性引物扩增后可见208 bp的特异性条带,经VP1基因测序进一步确定这些分离株为CA16。同源性和系统进化树分析表明,各毒株与shzh04-J31株的同源性最高,为92.4%~96.1%,均属于C基因亚型。病毒分离株在Vero细胞上连续传12代后,仅1株病毒的1个氨基酸发生改变。结论  成功分离到CA16毒株,其生物学特性稳定,可用于CA16疫苗的研发。