Nogo-66 调节神经细胞β淀粉样蛋白代谢的机制

目的：本文重点研究Nogo-66 对β淀粉样蛋白（Aβ）代谢的调节作用及其分子机制,对Nogo-66 作用机制进行完善;同时,探讨抑Nogo-66 作用对延缓和阻止AD 进程的影响。方法：①体外培养新生大鼠原代皮质神经元两天后,加入不同浓度的Nogo-66 处理,观察细胞形态及定量分析突起生长状况。②通过ELISA 检测不同浓度Nogo-66 作用原代皮质神经元后,Aβ的变化情况。提取新生大鼠原代皮质神经元后,培养两天,加入不同浓度的Nogo-66 处理,继续培养48 h,收集上清培养基,检测细胞分泌的Aβ40 和Aβ42 含量。③体外培养新生大鼠原代皮质神经元两天后,分别加入不同浓度的Nogo-66 受体阻断剂NEP1-40、受体下游信号分子ROCK（rho-associated coiledcoil-containing protein kinase）的抑制剂Y-27632 预保护1 h 后,用终浓度为1 μmol·L-1 的Nogo-66处理细胞,继续培养48 h,收集上清培养基,检测细胞分泌的Aβ40 和Aβ42 含量。④体外培养新生大鼠原代皮质神经元两天后,用2 μmol·L-1 的NEP1-40 和100 μmol·L-1 的Y-27632 进行预保护,采用1 μmol·L-1 的Nogo-66 处理细胞造模,Western Blotting 检测Nogo-66 下游信号ROCK 通路上各相关蛋白的表达及其磷酸化水平。结果：①形态学观测结果显示,当浓度为4 μmol·L-1、16 μmol·L-1时,神经元具有明显损伤。MAP2 免疫荧光结果显示,Nogo-66 能显著性抑制突起再生,0.25μmol·L-1、1 μmol·L-1 各剂量组皮质神经元平均突起长度显著性降低,具有效关系。表明Nogo-66能抑制原代皮质神经元突起的再生。②ELISA 结果显示,Nogo-66 能促进Aβ40 和Aβ42 含量。其中0.5 μmol·L-1、1 μmol·L-1 的Nogo-66 能显著增加原代皮质神经元培养基中的Aβ40 和Aβ42 含量,具有量效关系。③加入Nogo-66 受体阻断剂NEP1-40、ROCK 抑制剂Y-27632 后,ELISA 结果显示,与Nogo-66 模型组相比,2 μmol·L-1 的NEP1-40 能拮抗Nogo-66,显著性降低原代皮质神经元培养基中的 Aβ40 的含量;50 μmol·L-1、100 μmol·L-1 的 Y-27632 能拮抗Nogo-66,显著性降低培养基中的Aβ40 和Aβ42 的含量,但量效关系不明显。筛选出 NEP1-40 和Y-27632 最佳作用浓度分别为：2 μmol·L-1、100 μmol·L-1。④ELISA 结果显示,Nogo-66 模型组（只加Nogo-66,不加抑制剂）能显著增加原代皮质神经元和N2a 过表达细胞株（由澳门科技大学馈赠）培养基中Aβ40 和Aβ42 的含量。Nogo-66 受体阻断剂NEP1-40 和ROCK 抑制剂 Y-27632 能拮抗Nogo-66,显著性降低培养基中的Aβ40 和Aβ42 的含量。⑤Western Bolt 结果显示,0.5 μmol·L-1、1 μmol·L-1 的Nogo-66 能显著性增加原代皮质神经元细胞和 N2a 过表达细胞株的ROCK2 和磷酸化的CRMP2 的表达水平,且具有明显的剂量依赖性。结论：①Nogo-66 能抑制原代皮质神经元突起再生,且促进皮质神经元分泌Aβ40 和Aβ42;②Nogo-66 是通过激活Nogo-66 受体及下游信号分子ROCK2 和p-CRMP2 抑制原代皮质神经元突起再生并促进分泌 Aβ40 和Aβ42。     

常染色体隐性遗传性羊毛状发伴少毛症两家系基因突变分析

目的:检测常染色体隐性遗传性羊毛状发伴少毛患者家系的致病基因。方法:收集2例中国汉族常染色体隐性遗传性羊毛状发伴少毛家系患者及其父母外周血标本,应用二代皮肤靶向测序包检测血样中DNA的基因突变,Sanger测序进行家系验证,Minigene验证剪切突变致病性。结果:先证者1的LIPH基因检测到c.742C>A(p.His248Asn)和c.982+12A>G的复合杂合突变。先证者2的LIPH基因检测到c.629-1＿629delinsTT和c.686delAinsGTAGAACCCAACCTGGCT的复合杂合突变。一代测序验证显示复合杂合突变分别来自母亲和父亲。LIPH c.982+12A>G和c.629-1＿629delinsTT尚未报道过,Minigene验证发现,剪切突变c.982+12A>G会导致内含子滞留;剪切突变c.629-1＿629delinsTT会导致外显子跳跃和外显子缺失。结论:本文报道了LIPH的两个新剪切突变,通过家系验证和Minigene验证了剪切突变的致病性,丰富了LIPH导致常染色体隐性羊毛状发伴少毛的突变谱。