肠道菌群代谢物TMAO对糖尿病冠状动脉钙化的预测价值

目的探讨肠道菌群代谢物氧化三甲胺(TMAO)对糖尿病冠状动脉钙化的预测价值。方法选取行冠状动脉造影(CTA)的2型糖尿病患者为研究对象,根据Agatston钙化积分评分将其分为无钙化组、轻度钙化组、中度钙化组、重度钙化组。检测各组患者血清空腹血糖(FPG)、糖化血红蛋白(HbA1c)、总胆固醇(TC)、低密度脂蛋白(LDL)、TMAO水平。采用多元线性回归模型分析冠状动脉钙化的影响因素,通过受试者工作特征(ROC)曲线分析TMAO对冠状动脉钙化的预测价值。结果各组患者糖尿病病程、LDL、TMAO水平比较,差异有显著性(P＜0.05)。糖尿病病程、LDL、TMAO是冠状动脉钙化的影响因素;糖尿病患者冠状动脉钙化程度与血清TMAO浓度呈正相关(P＜0.05);ROC曲线下面积为0.80。结论糖尿病患者血清TMAO与冠状动脉钙化程度有关,可作为预测冠状动脉钙化的指标。     

Sortilin在糖尿病血管钙化演进中的作用机制

目的探究分拣蛋白(Sortilin)在糖尿病血管钙化中的作用机制。方法选取2015年6月至2017年6月在江苏大学附属医院骨科因糖尿病足截肢治疗的患者30例,根据钙定量检测胫前动脉钙化情况并分为对照组(钙定量2μmol/mg,n=15)和钙化组(钙定量≥2μmol/mg,n=15)。Western blot测定两组Sortilin水平,并对患者血清学及临床指标进行相关分析。基于人主动脉平滑肌细胞株(HA-VSMC)构建糖尿病血管钙化体外模型,利用茜素红染色检测钙化程度,Western blot检测该模型中Sortilin表达水平。而后用Sortilin及Sortilin中和性抗体处理该钙化模型,用钙盐染色和钙结节长径测定的方法显示Sortilin对于钙化模型的影响。结果钙化组胫前动脉钙化是对照组的4.9倍,同时Sortilin表达量也增加3.92倍。用含有羧甲基赖氨酸(CML)和氧化型低密度脂蛋白(oxLDL)的钙化培养液处理HA-VSMC后,钙化明显增加。在Sortilin重组蛋白刺激下,HA-VSMC钙化程度进一步加重,钙结节长径明显增加,同时组织非特异性碱性磷酸酶(TNAP)表达水平也显著提高。结论 Sortilin促进糖尿病血管钙化,并使其向大钙化发展。     

CML促进高脂诱导糖尿病ApoE－/－小鼠非酒性脂肪肝进展的研究

研究 Nε-羧甲基赖氨酸(CML)对非酒精性脂肪肝(NAFLD)的影响并探索其作用机制。首先通过体外实验,观察不同浓度CML对HepG2细胞脂质蓄积的影响。以6周龄雄性ApoE－/－小鼠腹腔注射链脲佐菌素40 mg/kg/day连续五天,2周后将血糖水平≥300 mg/dL的小鼠纳入实验研究;用免疫组化染色法检测CML的表达,HE染色观察肝脏形态以及检测血清总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)、超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)的变化。结果显示,不同浓度CML处理后,上调肝组织中CML表达。CML浓度依赖性升高小鼠血清TC、TG、AST、ALT、MDA 的含量,降低血清中 SOD、GSH-Px含量,加重肝脏脂肪变性,并增加HepG2细胞内脂质蓄积。结果表明CML促进高脂诱导糖尿病ApoE－/－小鼠非酒性脂肪肝进展。     

基质小泡在糖尿病足截肢患者胫前动脉斑块内钙化中的作用分析

基质小泡是多种矿物形成细胞分泌的一种膜性结构。已有研究证实,基质小泡是无定型磷酸钙结晶成核的起始位点,但基质小泡在糖尿病足截肢患者胫前动脉斑块内钙化中的具体作用如何,现有的研究尚未阐明。本实验选取2015年10月～2018年1月在本院行糖尿病足截肢手术的患者共40例,根据组织钙定量测定将患者分为低钙化组(钙定量<4 mol/mg,n=20)及高钙化组(钙定量>4 mol/mg,n=20)。采用一系列形态学染色、分子生物学技术检测及统计学分析,结果显示:随着钙定量增加,基质小泡标记蛋白表达明显增加,高钙化组基质小泡水平高于低钙化组。Pearson 相关分析显示基质小泡水平与斑块内钙定量呈正相关(r＝0.772 9,P<0.01)。ROC曲线显示曲线下面积为0.894(95% CI:0.788~0.999,P<0.01)。这些结果提示基质小泡水平与糖尿病动脉斑块内钙化的演进存在正相关,其水平对不同程度斑块内钙化有一定的预测价值。     

清道夫受体CD36在CML抑制泡沫细胞迁徙中的作用

目的探讨清道夫受体CD36在羧甲基赖氨酸(CML)抑制泡沫细胞迁徙中的作用。方法 (1)首先观察CML对RAW264.7巨噬细胞脂质蓄积和细胞迁移的影响,继之观察泡沫细胞中CML与CD36的相互作用,实验分为:对照组、氧化型低密度脂蛋白(ox-LDL)组(40 mg/L ox-LDL)、CML组(40 mg/L ox-LDL+10μmol/L CML);(2)观察CD36在CML抑制泡沫细胞迁移中的作用。实验分两部分:首先观察CD36抑制剂SSO对RAW264.7泡沫细胞迁移的影响,分对照组(40 mg/L ox-LDL+10μmol/L CML)和SSO组(40 mg/L ox-LDL+10μmol/L CML+25μmol/L SSO);其次观察不同受体阻断对CML抑制泡沫细胞迁移的影响,分对照组(40 mg/L ox-LDL+10μmol/L CML),anti-CD36组(40 mg/L ox-LDL+10μmol/L CML+2μmol/L anti-CD36),anti-RAGE组(40 mg/L ox-LDL+10μmol/L CML+2μmol/L anti-RAGE),mal BSA组(40 mg/L ox-LDL+10μmol/L CML+400 nmol/L mal BSA)。连续24 h 1%BSA的培养基培养干预后进行相关检测(油红O染色、Transwell细胞迁移实验、免疫共沉淀实验、CD36免疫荧光染色等)。结果胆固醇氧化酶法定量及油红O染色定性显示CML可以有效促进RAW264.7巨噬细胞脂滴的蓄积并形成动脉粥样硬化斑块的关键组分泡沫细胞。Transwell细胞迁移实验和定量分析结果显示:与对照组相比,ox-LDL组中迁移泡沫细胞数减少43.5%(P0.05);与ox-LDL组相比,CML使泡沫细胞迁移数目减少49.2%(0.287±0.031比0.565±0.061,P0.05),表明CML抑制RAW264.7源性泡沫细胞迁移。免疫共沉淀实验及免疫荧光染色结果显示泡沫细胞中CML-CD36存在显著的相互作用。进一步的,用SSO或中和性抗体anti-CD36阻断CD36和清道夫受体抑制剂mal BSA阻断所有清道夫受体情况下,迁移的细胞数均较对照组显著增加(P0.05)。统计学分析显示,anti-CD36组细胞迁移指数为mal BSA组的81.3%(2.35±0.39比2.89±0.41,P0.05)。结论清道夫受体CD36是CML抑制RAW264.7泡沫细胞迁移的关键受体。     

护骨素信号介导Ghrelin调控A7r5主动脉平滑肌细胞钙化

目的探讨胃促生长素(Ghrelin)与护骨素(OPG)/细胞核因子κB受体活化因子配体(RANKL)在钙化发生过程中的调控机制。方法首先观察高脂高糖培养基中A7r5(主动脉平滑肌细胞)钙化过程中Ghrelin的变化情况,继之观察外源性Ghrelin干预后高脂高糖钙化培养基中A7r5中OPG、RANKL的表达变化。最后观察Ghrelin与OPG/RANKL在钙化发生过程中的调控机制。各组细胞均于培养14天后进行相关检测(Von Kossa染色、茜素红染色、细胞外钙沉积量测定、免疫组织化学染色、Western blot检测)。结果 Von Kossa染色、茜素红染色及细胞外钙沉积量检测显示,高脂高糖及β-甘油磷酸盐模拟的糖尿病代谢紊乱环境下,A7r5钙沉积量显著增加了5.21倍。Ghrelin免疫组织化学染色及IPP6定量分析显示,随着钙化的形成与发展,Ghrelin表达明显下调。外源性Ghrelin可上调OPG相对表达量6.25倍。相对于高脂高糖钙化组,anti-OPG组钙沉积量增加了1.33倍(P0.05),RANKL组钙沉积量增加了1.59倍(P0.05);相对于antiOPG组,anti-OPG+Ghrelin组钙沉积量下调了41.9%(P0.05);相对于RANKL组,RANKL+Ghrelin组钙沉积量下调了57.8%(P0.05)。结论 OPG/RANKL可介导Ghrelin调控A7r5主动脉平滑肌细胞钙化。