翻译起始的调控与肿瘤靶向基因治疗

真核细胞主要通过高度结构化的5'端非翻译区(5' untranslated region, 5'UTR)实现mRNA翻译起始的调控,其主要作用方式有3种,即通过本身高度复杂的二级结构在空间上阻碍翻译起始、通过其包含的上游AUG密码子(uAUG)和上游开放阅读框(uORF)元件来抑制翻译起始,以及通过其包含的内部核糖体进入位点(IRES)元件的"非帽依赖"(cap-indepen-dent)起始途径来抑制翻译起始.肿瘤细胞通常会过表达真核起始因子4E(eukaryotic initiation factor 4E, eIF4E)、 eIF4A、eIF4G等,这些因子可以通过解开5'UTR的复杂结构特异性地解除5'UTR的翻译抑制作用.目前应用5'UTR进行肿瘤靶向性基因治疗的思路是把肿瘤杀伤基因置于5'UTR调控之下,利用肿瘤细胞过表达翻译起始因子来发挥5'UTR在肿瘤细胞中的翻译竞争优势,实现治疗基因在肿瘤细胞中的特异性表达,从而达到靶向杀伤肿瘤的目的.     

人釉原蛋白的原核表达、纯化及鉴定

目的构建含人釉原蛋白(hAm)成熟肽基因的重组原核表达质粒,在大肠杆菌中表达重组人釉原蛋白,鉴定经纯化获得的融合蛋白。方法利用限制性内切酶EcoRⅠ和SalⅠ将hAm基因插入原核表达载体PGEX4T1,对重组表达质粒PGEX4T1-hAm进行双酶切和测序鉴定。选择测序正确的质粒转化E.coli.RosettaTM,用终浓度0.3 mmol/L的IPTG诱导表达带有亲和标记谷胱甘肽-S-转移酶(GST)的重组hAm。经亲和层析纯化获得融合蛋白GST-hAm,并通过SDS-PAGE和Western blotting鉴定原核表达的重组hAm。结果重组质粒经双酶切和测序鉴定证实插入序列准确无误。在大肠杆菌RosettaTM中经IPTG诱导表达并纯化得到的融合蛋白GST-hAm,经SDS-PAGE鉴定分子量约为46000,主要以包涵体形式存在,与预测一致;Western blotting证实该融合蛋白能被特异性抗hAm多克隆抗体识别。结论成功构建含有hAm成熟肽基因的重组原核表达质粒,表达的融合蛋白GST-hAm可通过纯化获得,经鉴定为hAm。大量纯化的hAm成熟肽的获得为开展其功能研究奠定了基础。     

人釉原蛋白的原核表达、纯化及鉴定

目的 构建含人釉原蛋白(hAm)成熟肽基因的重组原核表达质粒,在大肠杆菌中表达重组人釉原蛋白,鉴定经纯化获得的融合蛋白.方法 利用限制性内切酶EcoR I和Sal I将hAm基因插入原核表达载体PGEX4T1,对重组表达质粒PGEX4T1-hAm进行双酶切和测序鉴定.选择测序正确的质粒转化E.coli.RosettaTM,用终浓度0.3 mmol/L的IPTG诱导表达带有亲和标记谷胱甘肽-S-转移酶(GST)的重组hAm.经亲和层析纯化获得融合蛋白GST-hAm,并通过SDS-PAGE和Western blotting鉴定原核表达的重组hAm.结果 重组质粒经双酶切和测序鉴定证实插入序列准确无误.在大肠杆菌RosettaTM中经IPTG诱导表达并纯化得到的融合蛋白GST-hAm,经SDS-PAGE鉴定分子量约为46 000,主要以包涵体形式存在,与预测一致;Western blotting证实该融合蛋白能被特异性抗hAm多克隆抗体识别.结论 成功构建含有hAm成熟肽基因的重组原核表达质粒,表达的融合蛋白GST-hAm可通过纯化获得,经鉴定为hAm.大量纯化的hAm成熟肽的获得为开展其功能研究奠定了基础.     

微RNA-378a-3p靶向SUFU基因促进乳腺癌细胞的增殖和迁移

目的:研究微RNA(microRNA,miRNA,miR)-378a-3p对乳腺癌细胞体外增殖、凋亡和迁移能力的影响,以及可能的作用机制.方法:利用GEO(Gene Expression Omnibus)数据库分析乳腺癌miR-378a-3p高表达患者与低表达患者的生存情况.使用实时荧光定量PCR法检测人乳腺癌细胞系以...