特异结合唾液酸化LewisX抗原DNA适配子抑制肝癌细胞株HepG2体外侵袭转移

目的 观察特异结合唾液酸化LewisX (SLeX)抗原DNA适配子抑制HepG2细胞与E-选择素黏附能力及其体外抑制HepG2细胞浸润转移能力.方法 采用黏附实验、Transwell体外侵袭实验,检测该适配子对HepG2细胞与E选择素黏附及对HepG2细胞体外侵袭的影响.结果 该DNA适配子可有效抑制HepG2细胞与E-选择素黏附,黏附细胞数随适配子浓度的增加而减少(P＜0.01),20 nmol浓度的适配子与单克隆抗体CSLEX-1效果相似;Transwell侵袭实验中,5、10、20nmol适配子组的侵袭细胞数分别为159.00±3.27、142.00±5.50、115.00±5.07,与对照组(178.00±4.64)比较,差异有统计学意义(P＜0.01).结论 特异结合唾液酸化LewisX抗原DNA适配子可以抑制HepG2细胞与E-选择素黏附,阻断Lewis-selectin途径,抑制HepG2细胞体外侵袭转移.     

虎杖苷对人宫颈癌SiHa和HCC94细胞增殖与凋亡的影响

目的探讨虎杖苷在体外对人宫颈癌SiHa细胞和HCC94细胞增殖与凋亡的影响。方法分别将不同浓度的虎杖苷(25、50、100μmol/L)在体外作用于人宫颈癌SiHa细胞和HCC94细胞后,用MTT法检测其增殖,流式细胞术检测其凋亡及周期。结果虎杖苷在体外对人宫颈癌SiHa细胞和HCC94细胞增殖均具有明显的抑制作用;流式细胞术结果显示,随着给药浓度的增加,SiHa细胞和HCC94细胞凋亡率逐渐增大,同时虎杖苷能够抑制SiHa细胞和HCC94细胞DNA的复制。结论虎杖苷在体外对人宫颈癌SiHa细胞和HCC94细胞增殖具有明显的抑制作用,并能诱导其凋亡,显示出较好的抗宫颈癌潜能。     

环状RNA circ_100290在结直肠癌中的表达及其临床意义

目的探讨环状RNA circ_100290在结直肠癌病人中的表达,及其与临床病理特征及预后的关系。方法实时荧光定量聚合酶链反应（qRT-PCR）法检测结直肠癌及其癌旁正常组织中环状RNA circ_100290的表达量。分析环状RNA circ_100290的表达差异与临床资料及病例特征的关系。生存曲线分析环状RNA circ_100290的表达差异与临床预后的相关性。Cox比例风险回归模型进行单变量和多变量回归分析。结果环状RNA circ_100290在结直肠癌组织中的相对表达水平高于癌旁肠正常组织（P < 0.01）。环状RNA circ_100290高表达与与淋巴结转移、远处转移、TNM分期有关（P < .05~P < 0.01）。生存曲线分析显示,与人环状RNA circ_100290表达低的病人相比,高表达的病人总生存的平均时间更短（P < 0.05）;单变量与多变量Cox比例风险回归模型分析均显示,环状RNA circ_100290表达水平、淋巴结转移、远处转移和TNM分期与结肠癌病人的总生存率均有关系（P < 0.05~P < 0.01）。结论环状RNA circ_100290高表达与结直肠癌转移和预后相关。因此,环状RNA circ_100290可以作为预测结肠癌病人预后的潜在生物标志物。     

pCGN-HAM-N1-wcAPC质粒的构建及其功能

目的 构建带有HAM标签的真核表达重组质粒pCGN-HAM-N1-wcAPC及探讨其功能.方法 制备高效率感受态;用聚合酶链反应(PCR)扩增,将腺瘤息肉病(APC)基因截短的片段APC1克隆于T载体;同时将pCMV-neo-bam-APC酶切,得到APC基因的另一个8300 bp截短片段kAPC亚克隆于pCGN-HAM-N1真核表达载体,得重组质粒pCGN-HAM-N1-kAPC;再运用双酶Sal Ⅰ和Kpn Ⅰ同时酶切TA克隆、pCGN-HAM-N1-kAPC,将APC1片段插入载体pCGN-HAM-N1-kAPC,获含野生型全长APC基因重组质粒pCGN-HAM-N1-wcAPC.用酶切,测序鉴定.脂质体法分别将含全长,截短的重组质粒,空载体与WNT信号系统的β-连环蛋白(β-catenin)、topflash和荧光素酶共同转染293T细胞,利用双荧光报告测试系统,检测转染后荧光素酶活性.结果 重组质粒经酶切其大小与预期一致,经测序比对证实与GeneBank中给出的序列一致.转染pCGN-HAM-N1-wcAPC组的荧光素酶活性明显低于转染空载体组pCGN-HAM-N1(P＜0.05).结论 含野生型全长9000 bp大片段APC基因分段成功插入pCGN-HAM-N1载体,带有HAM标签的真核表达重组质粒pCGN-HAM-N1-wcAPC构建成功,pCGN-HAM-N1-wcAPC抑制T细胞因子/淋巴增强因子(Tcf/Lef)启动子的活性.     

人白细胞介素-15与18的协同刺激体外活化肿瘤浸润淋巴细胞的作用

目的 观察白细胞介素(IL)-15与IL-18协同刺激活化肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)的作用.方法 用IL-15与IL-18共同刺激从结肠癌患者分离得到的肿瘤浸润淋巴细胞,通过测定其分泌转化生长因子(TGF)-β、IL-4、干扰素(IFN)-γ水平以及肿瘤浸润淋巴细胞的杀伤功能,观察IL-15与IL-18活化肿瘤浸润的淋巴细胞的功能.结果 IL-15与IL-18共同作用于肿瘤浸润淋巴细胞,能够抑制TGF-β、IL-4的分泌(P＜0.05),促进IFN-γ的分泌(P＜0.05),同时能提高肿瘤浸润淋巴细胞的杀伤活性.结论 IL-15与IL-18协同刺激能活化肿瘤浸润淋巴细胞.     

突变型p53蛋白DNA适配子的体外筛选与鉴定

目的 建立体外获得突变型p53蛋白DNA适配子(aptamers)的方法,为该适配子在肿瘤早期诊断及靶向治疗运用中奠定基础.方法 构建长度为75 nt的初始随机单链DNA库,其两端为固定序列,中间为35个随机序列,库容量为1 × 1017～1×1018,以溴化氰活化的琼脂糖小球为筛选介质,运用指数富集的配体系统进化技术(SELEX技术)经逐轮筛选获得突变型p53蛋白的DNA适配子.将适配子库克隆、测序,采用DNAMAN软件对其结构进行分析,通过生物素-亲和素-辣根过氧化物酶显色系统测定适配子与突变型p53蛋白的亲和力.结果 经逐轮筛选,所得适配子富集库与突变型p53蛋白的亲和力逐步提高,A450值从0.1357增加到了0.6818,其亲和力至第8轮筛选达最高水平后进入平台期.克隆第8轮筛选适配子库,测定23个克隆子的序列,其中20个克隆子的序列与预期相符.DNAMAN5.29软件分析表明,20个克隆子的一级序列同源率为76.51%,无共同保守序列,适配子的二级结构则以茎环、凸环结构为主.结论 经8轮筛选获得的DNA适配子与突变型p53蛋白的体外结合具有高度的特异性及亲和力,其克隆子无共同保守序列,适配子的高亲和性与其形成的茎环、凸环等空间结构密切相关.

Abstract：

Objective To set up a method to obtain single-stranded DNA aptamers of mutant p53 protein in vitro by SELEX technique and lay a foundation of application of these aptamers to carcinoma in early diagnosis and targeted therapy. Methods The initial length of 75 bp random single-stranded DNA library was constructedin vitro, both ends had a fixed sequence and there were 35 nucleotides in the middle of random sequence, with capacities of about 1×1017-1×1018. By means of cyanogen bromide (CNBr)activated agarose beads as screening medium, the ssDNA aptamers of mutant p53 protein were selected by SELEX technique. The aptamers were cloned and sequenced, and DNAMAN package was employed to analyze the conserved equences and the second structure of the aptamers. The affinity of aptamers to mutant p53 protein was determined by chromatic biotin-streptavidin-horseradish peroxides system. Results Through screening aptamers round by round, the affinity of aptamers to mutant p53 protein was increased gradually(the A450 values were increased from 0.1357 to 0.6818) and the affinity of aptamers at the round 8 was the highest, and then maintained at the prateau. Twenty out of 23 aptamers had the correct length and fixed sequence after cloning and sequencing. The DNAMAN5.29 sofeware analysis revealed that, the identity of 20 clones was 76. 51% without common conserved sequence and the second structure of the aptamers was stem-loop-based and bulge-based. Conclusion After selection of 8 rounds, the ssDNA aptamers we obtained had high specificity and affinity to mutant p53 protein in vitro and didn't have common conserved sequence. Stem-loops and bulge were the basis of aptamers binding to mutant p53 protein.     

人白细胞介素-15与18协同增强肿瘤浸润淋巴细胞体内对结肠癌细胞的杀伤功能

目的 观察白细胞介素(IL)-15与IL-18体内增强肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)杀伤功能的效果.方法 用IL-15与IL-18共同刺激从结肠癌患者分离得到的TIL,通过测定其分泌转化生长因子(TGF)-β、IL-4、干扰素(IFN)-γ水平以及TIL的杀伤活性.用IL-15与IL-18共同刺激的TIL与结肠癌细胞SW480共孵育后,接种到SCID鼠皮下,测定肿瘤生长的大小、肝脏转移的肿瘤结节多少、血清中IL-4、IFN-γ水平以及腹腔巨噬细胞的吞噬能力.结果 IL-15与IL-18共同作用于TIL,能够抑制TGF-β、IL-4的分泌(P＜0.05),促进IFN-γ的分泌(P＜0.05).IL-15与IL-18共同作用于TIL后,能明显提高TIL对结肠癌细胞SW480的杀伤活性(P＜0.05).肝脏转移的肿瘤结节明显减少,血清中IFN-γ水平明显升高,腹腔巨噬细胞的吞噬能力增强.结论 IL-15与IL-18协同刺激体内能增强TIL对结肠癌细胞的杀伤功能.     

Fas相关磷酸酯酶在食管癌中的表达及其临床意义

目的 观察食管癌患者癌组织中Fas相关磷酸酯酶(FAP-1)的表达,探讨FAP-1表达在肿瘤发生发展中的作用.方法 采用免疫组织化学SP法检测65例食管癌及16例食管良性病变标本中FAP-1蛋白的表达水平,12例正常食管组织为对照组.结果 FAP-1蛋白的阳性表达主要定位在细胞质内,少数也可见胞膜着色.FAP-1蛋白在正常食管组织中未见表达,良性病变中的表达率为12.5%,而在恶性肿瘤中的阳性表达率为76.9%,与前两者比较差异有统计学意义(P＜0.01).FAP-1的表达与肿瘤的分化程度和转移呈显著相关(P＜0.05),与年龄和肿瘤大小无明显相关(P＞0.05).结论 FAP-1在食管癌组织中阳性表达率高达76.9%,在临床有转移、分期晚和病理分级低的组织中表达增高,可能与食管癌的发生发展相关.     

食管癌患者外周血淋巴细胞热休克蛋白表达及其意义

目的 观察食管癌患者外周血淋巴细胞热休克蛋白(HSP)27和HSP72的表达,探讨其与临床病理生理特征的关系.方法 采用流式细胞术检测45例食管癌患者外周血淋巴细胞HSP27和HSFP72的表达水平,并以43例健康受试者作为对照.结果 食管癌外周血淋巴细胞HSP27、HSP72的表达量分别为17.32±2.97和19.46±5.91,均低于对照组(P＜0.05),两者表达量呈正相关(P＜0.01),食管癌外周血淋巴细胞HSP27的表达量与临床病理生理特征无明显相关(P＞0.05),而HSP72的表达量与食管癌原发肿瘤的大小、淋巴结转移及临床分期相关(P＜0.05).结论 食管癌外周血淋巴细胞HSP27、HSP72表达下调,HSP72与食管癌的发生发展及淋巴结转移相关.     

流式细胞术检测甲状腺癌患者外周血T细胞亚群及其与临床病理的关系

目的 探讨应用流式细胞术检测甲状腺癌患者细胞免疫功能的方法及其与临床病理的关系.方法 应用三色免疫荧光流式细胞仪测定25例甲状腺癌患者及10例甲状腺良性肿瘤对照者外周血T细胞亚群CD4+CD25+Treg/CD4+Treg比值.结果 甲状腺癌患者外周血中CD4+CD25+/CD4+(%)为72.62±3.16,良性肿瘤对照组为43.36±3.04,差异有统计学意义(P＜0.01),甲状腺癌患者外周血中CD4+CD25+/CD8+为0.70±0.08,良性肿瘤对照组为0.43±0.05,甲状腺癌中的升高更明显(P＜0.05).甲状腺癌外周血中的CD4+CD25+Treg细胞所占比值与甲状腺癌患者的年龄、性别、肿瘤的位置、大小、病理类型、临床分期无明显相关(P＞0.05).结论 甲状腺癌患者外周血中CD4+CD25+Treg增多.CD4+CD25+Treg与CD4+T细胞的比例亦升高.甲状腺癌患者外周血中CD4+CD25+Treg在甲状腺癌的早期即已经升高.