赖型钩体重组质粒pDJH_2亚克隆及其在大肠杆菌中的高效表达

为了探讨ｐＤＪＨ２的１．９ｋｂ０１７株钩体ＤＮＡ片段可否作为钩体重组疫苗广谱保护性抗原的候选，采用重组ＤＮＡ技术，将ｐＤＪＨ２的１．９ｋｂＤＮＡ片段分别与ｐＴ７－７，ｐＲＳＥＴ系列重组，转化入大肠杆菌进行亚克隆，ＩＰＴＧ诱导表达。结果显示：阳性亚克隆ｐＤＪｔ．ｐＤＪｒＢ１能在大肠杆菌中高效表达；对其进行ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析，可见６８ｋｄ和２３ｋｄ处出现新带，与钩体０１７株外膜同分子量蛋白带位置一致，免疫印迹（特异性抗０１７株外膜抗血清）在６８ｋｄ和２３ｋｄ处分别有印迹；用ｐＤＪｔ亚克隆重组质粒主动免疫豚鼠，可抵抗强毒力株攻击，表现出免疫保护作用。本实验结果提示：（１）ｐＤＪＨ２１．９ｋｂ重组ＤＮＡ片段能以不同质粒为载体，在不同大肠杆菌株中高效表达；（２）该重组ＤＮＡ片段表达产物——６８ｋｄ和２３ｋｄ蛋白，可能是赖型钩体０１７株外膜的保护性抗原。     

问号钩体血清型参考株16S rRNA基因的PCR－SSCP分析

利用１６ＳｒＲＮＡ基因引物扩增了我国致病性钩体１４群１５型参考株及赖型０１７株ＤＮＡ，通过非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，对各参考株的ＰＣＲ产物单链构象多态性进行了对比。结果显示在不同浓度凝胶及电泳条件下，１６株产物均有明显的２条单链，其中爪哇型、拜伦型、塔拉索夫型和曼耗Ⅱ型的国内参考株有相同的带型，而另１１型１２株的带型一致。此结果与Ｙａｓｕｄａ等（１９８７）和Ｒａ－ｍａｄａｓｓ等（１９９２）遗传学分种基本相符。     

问号赖型钩体重组质粒rpDJt表达蛋白P68免疫原性的研究

为构建一种新型钩体重组亚单位疫苗，采用问号钩体ｒｐＤＪｔ基因的蛋白表达物Ｐ６８免疫动物，对其免疫原性进行研究。结果显示：在体外，Ｐ６８能与其特异性抗血清及赖型钩体死菌苗抗血清呈明显高效价Ａｇ－Ａｂ反应；在体内，Ｐ６８能激起明显的Ｔ淋巴细胞转化，ＴＨ细胞活化，ＩＬ－２，ＩＬ－６活性增加。提示：ｒｐＤＪｔ表达蛋白Ｐ６８能激起机体强有力的Ｔ－Ｂ细胞协同性特异性体液免疫反应，是致病性强毒力钩体重组亚单位疫苗好的候选抗原之一。     

问号赖型钩端螺旋体重组质粒pDL121的初步研究

目的　探讨问号赖型钩端螺旋体抗原基因的特点。方法　应用６ 种常见内切酶（ＢａｍＨＩ,Ｂｇｌ Ⅱ,ＥｃｏＲⅠ,Ｈｉｎｄ Ⅲ,ＰｓｔⅠ,Ｐｖｕ Ⅱ）对从问号赖型钩端螺旋体０１７ 株的基因文库中筛选出来的重组质粒ｐＤＬ１２１ 外源基因进行酶谱分析,同时用Ｄｉｇｏｘｉｎ 标记的ｐＤＬ１２１ 外源基因片段作探针对不同种属的致病性钩端螺旋体和非致病性钩端螺旋体基因进行杂交分析。结果　显示问号赖型钩端螺旋体重组质粒ｐＤＬ１２１ 外源基因没有６ 种内切酶的酶切位点,重组探针与致病性钩体（ｓｅｒｏｖａｒｌａｉｓｔｒａｉｎ０１７,ｓｅｒｏｖａｒ ｈｅｂｄｏｍａｄｉｓｓｔｒａｉｎ ５６６１０ ,ｓｅｒｏｖａｒ ｐｏｍｏｎａｓｔｒａｉｎ ５６６０８）有杂交信号,与非致病性钩体（ｓｅｒｏｖａｒ ｐａｔｏｃ ｓｔｒａｉｎ Ｐａｔｏｃ Ⅰ,ｓｅｒｏｖａｒｉｌｌｉｎｉｓｔｒａｉｎ ３０５５）无杂交信号,亦不识别大肠杆菌。结论　重组质粒ｐＤＬ１２１ 外源基因可能是问号赖型钩端螺旋体的一个新基因,进一步测序分析将揭示该基因本质,同时因该重组探针能鉴别致病性钩体和非致病性钩体,提示其可用于钩端螺旋体病的早期诊断及钩端螺旋体的鉴定和分类。     

问号赖型钩端螺旋体23kDa蛋白的免疫原性研究

目的 探讨ｐＤＬ１２１的１．０ｋｂ０１７株问号赖型钩端螺旋体ＤＮＡ片段可否作为钩体重组疫苗广谱保护性抗原的侯选。方法 采用ＳＤＳ－ＰＡＧＥ制备２３ｋＤａ蛋白,免疫日本大耳兔制备抗２３ｋＤａ抗血清,Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ鉴定其免疫原性。结果 ２３ｋＤａ重组抗原兔抗血清可识别ｐＤＬ１２１体外表达２３ｋＤａ抗原产物和问号赖型钩端螺旋体０１７株超声抗原成份;用Ｗｅｓｔｅｍ ｂｌｏｔ鉴定抗血清效价,其抗体     

赖型钩体pDC38核酸序列测定及其与流感伤寒型钩体外膜蛋白基因ompL1核酸序列的类似性匹配

为了探讨赖型钩体 ｐ Ｄ Ｃ３８ 插入片段基因组 Ｄ Ｎ Ａ 编码、位置与ｏｍ ｐ Ｌ１ 基因的关系,作者采用在流感伤寒型钩体外膜蛋白基因ｏｍ ｐ Ｌ１ 首尾区段设计一对引物,以 ｐ Ｄ Ｃ３８ 插入片段作模板进行 Ｐ Ｃ Ｒ 扩增、测定和类似性匹配（ａｌｉｇｎｍ ｅｎｔ）。结果发现：ｐ Ｄ Ｃ３８ 含有 ２．７ｋｂ 和３．０ｋｂ 两个插入片段,３．０ｋｂ 片段含有 １ 个ｏｍ ｐ Ｌ１ 基因全拷贝。结论：类似性匹配表明,ｐ Ｄ Ｃ３８ 和ｏｍ ｐ Ｌ１ 相同碱基８６４ 个（９０％ ）,碱基变异（不配对）９６（１０％ ）个, ｐ Ｄ Ｃ３８ 可用于钩体诊断、分类、鉴定、疫苗和发病机理的研究。     

问号赖型钩端螺旋体23 kDa蛋白的免疫原性研究

钩端螺旋体病（简称钩体病）是分布最广的一种人兽共患病，已有７７个国家和地区有钩体病的流行，给人类和畜牧业造成了严重危害。为了控制钩体病流行，目前多采用全菌死疫苗。但是，全菌死疫苗免疫持久性不强，而且需多次注射，因而有严重的局限性。因此，寻找由钩体基因编码的保护性抗原，使之持久地抵抗侵入机体的钩体，已成为钩体病研究的课题。我们前文已报道问号赖型钩端螺旋体重组质粒ｐＤＬ１２１可表达被全钩抗血清识别的２３ｋＤａ蛋白（刘洪斌等，以Ｌａｍｂｄａｇｔ１１作载体构建赖型钩体基因文库及其重组质粒ｐＤＬ１２１的克…     

问号赖型钩端螺旋体重组质粒pDL121及其表达产物的初步研究

目的:探讨问号赖型钩端螺旋体重组质粒pDL121外源基因及其表达产物23 kDa蛋白的特点。方法:用6种内切酶对pDL121行酶谱分析,用Digoxin标记的pDL121外源基因片段作探针对不同种属的钩体进行杂交,用SDS-PAGE制备23 kDa蛋白,Western blot鉴定其免疫原性。结果:pDL121外源基因没有6种内切酶的酶切位点,重组探针与致病性钩体(serovar lai strain 017,serovar hebdomadis strain56610,serovar pomona strain 56608)有杂交信号,与非致病性钩体(serovar patoc strain Patoc I,serovar illini strain 3055)无杂交信号,亦不识别大肠杆菌。23 kDa兔抗血清可识别pDL121体外表达的23 kDa蛋白带和赖型钩体017株超声抗原成份;其抗体滴度为1/12800;用pDL121细菌裂解液主动免疫豚鼠,可使豚鼠抵抗强毒力株钩体攻击。结论:pDL121外源基因可能是赖型钩体的一个新基因;该重组探针能鉴别致病性钩体和非致病性钩体;23 kDa抗原有良好的免疫原性,可能是赖型钩体017株的保护性抗原。     

钩体内鞭毛蛋白基因重组质粒的构建、表达和免疫保护性研究

对钩端螺旋体病的有效预防亟需广谱、高效、安全、价廉的疫苗。为了获得重组表达的钩体内鞭毛亚单位蛋白抗原,以探讨制备新疫苗的途径,我们设计一对引物（Ｐ１＝５’－ＧＣＣＧＴＣＧＡＣＡＴＧＡＴＴＡＴＣＡＡＴ－３’,Ｐ２＝５’－ＧＧＣＴＡＧＣＴＡＴＴＡＧＡＴＡＴＧＣＴＧＣＡＧ－３’）,以赖型０１７株钩体ＤＮＡ为模板,利用ＰＣＲ扩增其编码基因完整的开放阅读框架,扩增产物经ＳａｌＩ、ＣｌａＩ双酶切消化后定向克隆于ｐＴ７－７载体上,构建原核表达重组质粒ｐＬＦ２。将该质粒转化入大肠杆菌ＪＭ１０９（ＤＥ３）中,经Ｉ…     

赖型钩体DNA重组质粒rpDJt及其表达蛋白P68对豚鼠的免疫保护研究

为了进一步鉴定赖型钩体ＤＮＡ重组质粒ｒｐＤＪｔ及其纯化表达蛋白质Ｐ６８的免疫保护作用，采用随机、双盲和对照法对５０只豚鼠进行了３次和６个部位主动免疫接种，并于接种后３０天以强毒力、大剂量活钩体攻击。结果：Ｐ６８组存活率１００％（７／７）；ｒｐＤＪｔ组存活率７７％（１０／１３）；ｐＴ７－７组（无重组质粒）存活率２５％（３／１０）；全钩灭活疫苗组存活率９３％（１３／１４）。作者认为该质粒的表达蛋白质Ｐ６８可作为钩体基因工程亚单位疫苗的候选抗原。