医学微生物学与免疫学理论教学改革初探

医学微生物学与免疫学知识量大、内容繁杂、系统性不强，难于记忆。目前教学内容繁冗、教学方法单一。只有对教学内容以及教学方法进行改革，才能减轻学生学习负担，提高教学效果。该文对医学微生物学和免疫学理论教学内容、教学方法的改革谈点个人看法。     

丙型肝炎病毒HLA-A＊0201限制性CTL表位免疫学效应研究

目的：研究前期实验鉴定的2条丙型肝炎病毒HLA-A＊0201限制性CTL（活化的CD8＋T细胞）表位的体内外免疫学效应。方法：采用丙型肝炎病毒HLA-A＊0201限制性CTL表位肽C_181（LLSCLTTPV）和NS2_172（VLQAGLIRV）分别体外刺激HLA-A＊0201阳性健康志愿者外周血单个核细胞（PBMCs）和免疫HLA-A＊0201转基因小鼠,采用酶联免疫斑点实验（ELISPOT）和细胞内细胞因子染色（ICS）/流式细胞术检测表位肽特异性CD8＋T细胞的水平。结果：C_181和NS2_172诱导HLA-A＊0201阳性PBMCs产生了高水平的肽特异性分泌IFN-γ的细胞和肽特异性IFN-γ＋CD8＋T细胞;在C_181和NS2_172免疫的HLA-A＊0201转基因小鼠脾细胞中检测到了肽特异性分泌IFN-γ的细胞和肽特异性IFN-γ＋CD8＋T细胞。结论：C_181和NS2_172具有较好免疫学效应,有望用于研发CTL表位肽疫苗。     

登革病毒血清型2 E蛋白Ⅲ区单克隆抗体的制备及其诊断特异性研究

本研究旨在制备抗登革病毒(dengue virus,DENV)血清型2 (DENV2)E蛋白Ⅲ区(envelope protein domainⅢ,EDⅢ)单克隆抗体(简称单抗)并研究其诊断特异性。合成编码DENV2-EDⅢ的基因并将其克隆入原核表达质粒pET21a;将重组质粒转入大肠埃希菌菌株BL21;用重组表达的EDⅢ免疫小鼠;将小鼠脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞株SP2/0融合;将可产生识别抗EDⅢ单抗的杂交瘤细胞注入小鼠腹腔;采用蛋白G亲和层析法从腹水中纯化单抗;采用间接ELISA和间接免疫荧光法(indirect immunofluorescence assay, IFA)评估所制备的单抗识别DENV血清型1～4 (DENV1～4)的能力。本研究成功表达了DENV2-EDⅢ,并制备出3株杂交瘤细胞,杂交瘤细胞所分泌的小鼠源性单抗既可识别DENV2,又可交叉识别DENV1、DENV3和DENV4。     

丙型肝炎病毒HLA-A＊1101和A＊2402限制性CD8＋T细胞表位的研究

目的：鉴定出丙型肝炎病毒（HCV）特异性HLA-A＊1101限制性和A＊2402限制性CD8＋T细胞表位.方法：采用T细胞表位预测软件SYFPEITHI预测HCV特异性CD8＋T细胞表位,合成HLA-A＊1101限制性、A＊2402限制性候选表位;建立永生化的HLA-A＊1101阳性、A＊2402阳性B细胞株,采用竞争性肽结合实验检测候选表位与HLA-A＊1101或A＊2402分子的结合力;候选表位体外分别刺激HLA-A＊1101阳性或A＊2402阳性HCV感染者外周血单个核细胞（PBMCs）后,采用酶联免疫斑点（ELISPOT）和细胞内细胞因子染色（ICS）实验分别检测肽特异性分泌γ-干扰素（IFN-γ）的细胞的水平和（肝） 异性IFN-γ＋CD8＋T细胞的水平.结果：5条HLA-A＊1101限制性候选表位中,NS3_609（ITLTHPITK）和NS2_165（VVFSDMETK）与HLA-A＊1101分子具有高结合力.3条HLA-A＊2402限制性候选表位中,NS3_373 （KCDELASKL）和NS5b_382 （YYLTRDPTI）与HLA-A＊2402具有高结合力;在HLA-A＊1101阳性HCV感染者PBMCs中存在NS3 609和NS2_165特异性分泌IFN-γ的CD8＋T细胞,而在HLA-A＊2402阳性HCV感染者PBMCs中存在NS3_373和NS5b 382特异性分泌IFN-γ的CD8＋T细胞.结论：本研究证实NS3_609（ITLTHPITK）和NS2_165（WFSDMETK）为全新的HCV特异性HLA-A＊1101限制性CD8＋T细胞表位,NS3_373 （KCDELASKL）和NS5b_382 （YYLTRDPTI）为全新的HCV特异性HLA-A＊2402限制性CD8＋T细胞表位.     

丙型肝炎病毒非结构区5个细胞毒性T细胞表位的鉴定

目的 采用T细胞表位预测软件结合体外实验鉴定丙型肝炎病毒(HCV)特异性细胞毒性T细胞(CTL)表位.方法 采用T表位预测软件Rankpep预测HCV特异性CTL表位,选择候选CTL表位加以合成;用候选CTL表位肽分别刺激HCV感染者以及健康志愿者的外周血单个核细胞(PBMC),采用酶联免疫斑点试验(ELISPOT)检测PBMC中肽特异性分泌IFN-γ的斑点形成细胞(spots forming cells,SFC)的水平,采用细胞内细胞因子染色(intracellular cytokine staining,ICS)检测PBMC中肽特异性IFN-γ+CD8+T细胞的水平.结果 用5条候选CTL表位肽[NS3 450(TVPQDAVSR)、NS3 594(GPTPLLYRL)、NS4b 78(SMMAFSAAL)、NS5a 416(SEENVSVVF)和NS5a 367(TVSSALAEL)]分别刺激10个HCV感染者和2个健康者的PBMC后,健康者的PBMC不产生IFN-γ而7个HCV感染者的PBMC产生IFN-γ;HCV感染者的PBMC中肽特异性分泌IFN-γ的细胞的频率为(5-36)SFC/105 PBMC,肽特异性IFN-γ+CD8+T细胞占总CD8+T细胞的百分比为0.02%～0.25%.结论 ELISPOT结果和ICS结果证实5条肽NS3 450、NS3 594、NS4b 78、NSSa 416和NS5a 367为全新的HCV特异性CTL表位.     

温州地区62例HCV感染者的基因型特征研究

目的：探讨温州地区丙型肝炎病毒（HCV）感染者的HCV的基因型特征。方法：采用RT巢式-PCR法,对62例HCV-IgG阳性者进行HCV-RNA的检测及基因分型。结果：62例研究者中,HCV基因型1b单阳性率为35．48％,基因型2a单阳性率为3．23％,1b和2a双阳性率为61．29％,1b总阳性率为96．77％,2a总阳性率为50％。结论：温州地区HCV的基因型以1b型占优势,并且基因型1b和2a混合感染率较高。     

广州市登革1型病毒基因组测序及系统进化分析

目的：对引起2002年广州登革热的登革1型病毒分离株（71/02GZ）进行全基因组测序和系统进化分析。方法：采用C6/36细胞培养71/02GZ,分别采用RT-PCR,5’RACE和3’RACE扩增基因组中编码区序列、5’和3’末端非编码区序列,PCR产物克隆到载体并测序,拼接成全基因组序列,分别基于E基因序列、E/NS1连接区240 nt、基因组中10 016 nt进行系统进化分析。结果：71/02GZ株基因组全长10 735 nt,两端非编码区（NCR）长度分别为94 nt和462 nt。基于E基因序列、E/NS1连接区240 nt、基因组中10 016 nt的进化分析结果显示71/02GZ株和2002年广州分离株（GZ01/02,GZ/218/2002）,1995年广东分离株（GD23/95,GD01/95）、1995年广州分离株（GZ01/95）组成一个基因型;而1999年广东分离株（GD05/99）,1997年广东分离株（GD14/97）和1980年广州分离株（GZ/80）属于另一个基因型;另外,71/02GZ株同1998年印度尼西亚分离株（98901530 DF DV-1-ID）的同源性最高。结论：71/     

人白细胞抗原-A*0201限制性丙型肝炎病毒细胞毒性T淋巴细胞表位的鉴定

目的 鉴定人白细胞抗原(HLA)-A*0201限制性HCV-CTL表位.方法 基于RANKpep和SYFPEITHI细胞表位预测软件预测结果,选择合成6条候选CTL表位.研究候选CTL表位肽与T2细胞表达的HLA-A*0201分子的亲和力,进一步采用酶联免疫斑点实验(ELISPOT)和细胞内细胞因子染色(ICS)实验研究HLA-A*0201高亲和力肽在HLA-A*0201阳性HCV感染者的外周血单个核细胞(PBMC)中刺激CTL反应情况.结果 在6条候选CTL表位肽中,肽C_181(LLSCLTTPV)和NS2_172(VLQAGLIRV)与HLA-A*0201分子有高亲和力,其亲和力随肽浓度增加而升高.在10例HLA-A*0201阳性HCV-1b感染者每1×105PBMC中,肽C_181和NS2_172刺激后,特异性分泌IFN-γ细胞的斑点形成细胞数(SFC)分别为0～19和0～20.肽C_181和NS2_172特异性IFN-γ+CD8+T淋巴细胞占CD8+T淋巴细胞的比例分别为0.006%～0.065%和0.005%～0.080%.结论 肽C_181(LLSCLTTPV)和NS2_172(VLQAGLIRV)为HLA-A*0201 限制性HCV-CTL表位.     

罗格列酮对果糖饲养大鼠血糖血脂及血管重构的影响

目的　研究罗格列酮 (Rosiglitazone)对高果糖饲料饲养SD大鼠血管重构的作用和对血糖血脂的影响。方法　高果糖饲料饲养SD大鼠 1mon ,随机分为两组 :高果糖组 ,继续喂养高果糖饲料 1mon ;高果糖罗格列酮处理组 ,喂高果糖饲料和罗格列酮 (5mg·kg-1·d-1,溶于饮水中 ) 1mon。最后 ,每组一半大鼠麻醉从心脏取空腹血测血糖、血脂、胰岛素。每组另一半取主动脉和肠系膜小动脉 ,固定 ,切片 ,HE染色 ,用病理分析系统测量主动脉和肠系膜小动脉重构指标 :内径、中膜、中膜 /内径、中膜横切面积。结果　高果糖罗格列酮处理组与高果糖组对比 ,罗格列酮降低了血压 (16 0kPavs 18 0kPa ,P <0 0 1)、胰岛素 (34 89mIU·L-1vs5 3 5 6mIU·L-1,P <0 0 1)、甘油三酯 (0 5 6mmol·L-1vs1 16mmol·L-1,P <0 0 5 ) ,升高了胰岛素敏感指数 :血糖 /胰岛素的值 (0 2 6vs 0 14 ,P <0 0 5 ) ;增加了肠系膜小动脉内径 (173 0 μmvs 10 0 0 μm ,P <0 0 1) ,减小了中膜 (18 8μmvs 2 4 5 μm ,P <0 0 5 ) ,减小了中膜 /内径(10 90 %vs 2 5 5 5 % ,P <0 0 1) ;减小了主动脉中膜 (89 0μmvs 10 9 0 μm ,P <0 0 1) ,减小了中膜 /内径 (5 74 %vs6 80 % ,P <0 0 1)。结论　罗格列酮能降低果糖饲养SD大鼠的高血压 ,?     

丙型肝炎病毒CTL表位的HLA-A2限制性及其免疫学效应研究

目的 研究前期鉴定的5条丙型肝炎病毒(HCV)特异性细胞毒性T细胞(CTL)表位的HLA-A2限制性及其免疫学效应.方法 基于T2胞株,采用MHC-肽复合物稳定性试验研究前期鉴定的HCV特异性CTL表位与HLA-A2分子的亲和力;采用细胞内细胞因子染色(intracellular cy-tokine staining,ICS)和ELISPOT研究七述HLA-A2限制性CTL表位体外刺激HLA-A2刚性外周血单个核细胞(PBMC)产生肽特异性CTL的效应;采用CTL杀伤试验研究上述肽特异性CTL杀伤靶细胞(负载相同肽的T2细胞)的效应.结果 前期研究鉴定的5条CTL表位肽中,NS4b_78(SMMAF-SAAL)和NS5a_367(TVSSALAEL)与HLA-A2分子有高亲和力(FI1);ELISPOT结果显示NS4b_78(SMMAFSAAL)和NS5a_367(TVSSALAEL)可诱导高水平的分泌IFN-γ的效应细胞[分别为(60±6)SFC/10~4PBMC vs(4±1)SFC/10~4PBMC,P<0.001;(10±3)SFC/10~4PBMC vs(2±1)SFC/10~4PBMC,P<0.001];ICS结果证实这两条肽刺激HLA-A2阳性PBMC后,在CD8~+T细胞中产生了高百分比的CD8~+IFN-γ~+T[分别为(2.33±0.22)%vs(0.05±0.01)%,P<0.001;(0.36±0.06)%vs(0.03±0.01)%,P<0.001];并且,肽特异性CTL可特异性杀伤负载相同肽的T2细胞.结论 NS4b_78(SMMAFSAAL)和NS5a_367(TVSSALAEL)受HIA-A2限制,并具有较好的免疫原性.