表达翻转重组酶的真核载体的构建

目的 构建表达翻转重组酶(FLP)重组表达的真核载体.方法 以质粒pFRT为模板,用聚合酶链反应(PCR)扩增出两端包含了Xba Ⅰ和BamH Ⅰ内切酶识别位点的全长FLP基因片段,将该片段插入用Nhe Ⅰ和BamH Ⅰ双酶切后的载体质粒pBK-CMV上,构建出重组质粒pBK-CMV-FLP.经过转化、挑选菌落,PCR鉴定且测序均正确.结果 成功构建重组质粒pBK-CMV-FLP.结论 构建好的pBK-CMV-FLP质粒为生物工程上删除筛选标记物提供了良好的条件.     

Zeocin和GFP双筛选标记重组痘苗病毒载体的构建

目的 为研究重组痘苗病毒通用载体,构建融合Zeocin和GFP双筛选标记质粒pCB-ZeoGFP.方法 质粒LeGo-G/Zeo含有Zeo-GFP融合基因片段,通过PCR反应、BamHI酶切后连接替换空白质粒pCB的筛选基因gpt,通过菌落PCR,酶切图谱分析及测序分析鉴定重组质粒,构建成功后将其与野生型痘苗病毒进行位点特异性同源重组,经Zeocin药物筛选2代后,用流式细胞仪观察重组痘苗病毒GFP表达.结果 经菌落PCR,1号、5号和10号菌落中扩增出426 bp 的目的条带,与预期的大小完全一致,经酶切分析和DNA测序进一步验证了重组质粒pCB-Zeo-GFP;该质粒与野生型痘苗病毒同源重组,得到了重组的痘苗病毒；Zeocin 筛选2代后,病毒上清感染细胞,流式细胞分析7.18％的细胞中有CFP的表达,而阴性对照仅有1.43％；Zeocin 药物筛选5代后,通过激光共聚焦可在80％以上的细胞中观察带GFP;提取的重组痘苗基因组DNA也扩增出预期大小目的条带.结论 含Zeocin和GFP双筛选标记的新型重组痘苗病毒不仅具有可观察性且具有药物抗性,非常容易进行筛选鉴定.