基于SSUrRNA基因序列的间日疟原虫LAMP检测技术的建立

目的克隆分析间日疟原虫小亚基亚单位核糖体核糖核酸(SSUrRNA)特异性基因序列,建立间日疟原虫环介导等温扩增(LAMP)检测技术。方法针对间日疟原虫SSUrRNA种特异性基因序列设计1对引物,采用聚合酶链反应(PCR)从血样核酸提取物中扩增SSUrRNA基因片段,纯化后与pGEM-Teasy载体连接,构建重组质粒并转化大肠埃希菌JM109,PCR与双酶切鉴定筛选阳性克隆并测序,设计6条寡核苷酸片段,LAMP检测感染血样中间日疟原虫DNA,扩增产物作琼脂糖电泳分析或直接荧光染色肉眼观察。结果间日疟原虫SSUrRNA基因扩增片段大小约为235 bp;阳性克隆重组质粒插入的SSUrRNA基因扩增片段含有235个核苷酸,与GenBank中的Sal-1株、Belem株间日疟原虫相同序列进行比对,同源性为100%,与PV2008/TR/DEL株、PVK1294株、E1 Salvador株的同源性均为99%,与三日疟原虫、卵形疟原虫及恶性疟原虫的序列同源性均低于95%。将含有SSUrRNA靶基因的重组质粒以蒸馏水倍比稀释后做LAMP,试验的灵敏度为10 copy/μl;特异性检验显示间疟原虫患者血样DNA呈阳性反应,恶性...     

间日疟原虫海南株SSUrRNA编码基因的克隆及其序列分析

目的克隆间日疟原虫海南株红内期小亚基核糖体核糖核酸（SSUrRNA）编码基因片段,并进行序列特征分析。方法采用聚合酶链反应技术从海南间日疟患者血样DNA中扩增出间日疟原虫SSUrRNA基因片段,纯化后与pGEM-Teasy质粒连接构建重组子并转化大肠杆菌JM109;阳性克隆以双酶切和PCR鉴定后,进行序列测定,采用BLAST软件分析其特征。结果 PCR扩增出间日疟原虫红内期SSUrRNA基因特异性片段大小约为998 bp;阳性克隆重组质粒经双酶切及PCR鉴定与预期结果一致;核酸序列测定显示插入的SSUrRNA基因扩增片段,含有998个核苷酸,与GenBank中的间日疟原虫Sal 1株、Pv2008/TR/DEL株及El Salvador株相同序列进行比对,其同源性均大于99%。结论成功克隆间日疟原虫海南株红内期SSUrRNA编码基因序列,该序列在不同地理株间相对稳定保守。     

不同地理株间日疟原虫SSUrRNA基因序列比较

目的测定我国间日疟原虫不同地理株红内期SSUrRNA基因序列,比较分析其分子特征。方法收集深圳、海南、湖北和河南四地间日疟患者血样5份（其中海南2份）,并提取核酸DNA,采用PCR从核酸提取物中扩增出间日疟原虫SSUrRNA基因片段,纯化后分别与pGEM—Teasy质粒连接构建重组子并转化大肠杆菌JM109;阳性克隆以双酶切鉴定后,双脱氧末端终止法测定序列,采用BLAsT和MEGA4软件分析序列相互关系特征。结果5株间日疟原虫SSUrRNA基因扩增片段大小一致,约为998bp;核酸序列测定结果显示,所克隆的SSUrRNA基因片段均含有998个核苷酸,不同地理株间SSUrRNA基因序列有9个位点存在变异的可能,两两比对的同源性均高于99．5％,其中河南与湖北株序列的同源性为100．0％;与GenBank中报道的国外6株间日疟原虫相同序列作分子系统进化分析。国内5株间日疟原虫SSUrRNA基因序列与Sa11株遗传距离小,亲缘关系接近。结论测定的国内间日疟原虫SSUrRNA基因序列在不同地理株间相对保守．其间存在的单核苷酸多态性与地理变化有一定程度的关系。