乙型肝炎病毒X蛋白通过降低P4启动子甲基化水平上调人IGF-II基因的转录

目的:构建稳定表达乙型肝炎病毒X蛋白(HBx)的肝癌细胞株HepG2-HBx,探讨HBx对胰岛素样生长因子 II(IGF-II)基因P4启动子甲基化水平及转录表达的影响。方法:应用基因重组技术,构建含HBx基因的重组逆转录病毒载体pBABE-puro-HBx,采用磷酸钙共沉淀法将其转染293FT包装细胞产生逆转录病毒,感染HepG2肝癌细胞,采用嘌呤霉素进行阳性克隆筛选,Western blotting鉴定表达HBx蛋白的肝癌细胞株HepG2-HBx。采用亚硫酸氢盐测序法及实时荧光定量RT-PCR检测HepG2-HBx细胞中P4启动子甲基化水平及P4 mRNA表达水平变化。进一步将体外甲基化的人IGF-II基因P4启动子驱动的荧光素酶报告载体pGL3-P4及含HBx基因的pCMV-tag2B-X质粒共转染HepG2肝癌细胞,采用亚硫酸氢盐测序法及双萤光素酶实验检测pGL3-P4载体上P4启动子甲基化水平及转录调控活性变化。结果:(1)经Western blotting鉴定,成功构建了稳定表达HBx蛋白的肝癌细胞株HepG2-HBx;(2)表达HBx蛋白的HepG2-HBx细胞中P4启动子甲基化CpG位点的比例(9.0%)明显低于对照细胞HepG2-control(25.0%)(P<0.01),而其P4 mRNA表达水平则为对照细胞HepG2-control的2.8倍;(3)共转染pCMV-tag2B-X质粒的HepG2细胞中pGL3-P4载体上P4启动子甲基化CpG位点的比例(60.8%)明显低于共转染对照质粒pCMV-tag2B的HepG2细胞(84.1%)(P<0.01),而前者P4启动子相对萤光素酶活性(14.12±0.89)则明显高于后者(4.61±0.76)(P<0.01)。结论:HBx蛋白可降低IGF-II基因P4启动子甲基化水平,进而上调其转录表达。     

抑制IGF2基因的siRNA表达载体对肝癌Huh-7细胞增殖的抑制作用

目的:研究抑制人胰岛素样生长因子2(IGF2)基因的siRNA表达载体对肝癌Huh-7细胞增殖的抑制作用。方法:将重组人甲胎蛋白(hAFP)和人端粒酶逆转录酶(hTERT)双启动子调控抑制IGF2基因的siRNA表达载体pGL3-h AFP-hTERT-siRNA3(简称siRNA3)转染Huh-7细胞和正常肝L-02细胞,另设阴性对照(载体p GL3-hAFP-hTERT)组和空白对照组。采用实时荧光定量聚合酶链反应法检测各组细胞转染48 h后IGF2 mRNA表达;酶标仪检测转染0、24、48、72 h后的细胞活性;流式细胞仪检测转染48h后细胞周期、细胞凋亡;Western blot法检测细胞IGF2、增殖细胞核抗原(PCNA)、细胞周期蛋白(Cyclin)E2、Cyclin D2、Cdc2、Bcl-2蛋白表达水平。结果:与阴性对照组和空白对照组比较,转染siRNA3的Huh-7细胞中IGF2 mRNA表达明显减弱,转染48、72 h后Huh-7细胞活性明显降低,G1期Huh-7细胞明显增加,S期Huh-7细胞明显减少;Huh-7细胞早期、晚期及总凋亡百分比均明显增加,IGF2、PCNA、Cyclin E2、Cyclin D2、Cdc2和Bcl-2蛋白表达均明显减弱,以上差异具有统计学意义(P<0.01或P<0.05)。转染siRNA3表达载体的L-02细胞上述指标均无明显变化(P>0.05)。结论:重组hAFP和hTERT双启动子调控针对IGF2基因的siRNA可特异性抑制Huh-7细胞IGF2表达及细胞增殖,其可能与下调IGF2 mRNA及蛋白表达,进而引起细胞增殖相关基因PCNA、细胞周期调控相关基因Cyclin E2、Cyclin D2、Cdc2及细胞凋亡调控相关基因Bcl-2蛋白表达下调有关。     

hAFP及hTERT双启动子调控的针对人IGF-II基因的siRNA特异性抑制人肝癌细胞生长

 目的：设计并筛选高效沉默胰岛素样生长因子II（IGF-II）基因的小干扰RNA（siRNA）序列,构建由重组人甲胎蛋白（hAFP）和人端粒酶逆转录酶（hTERT）双启动子调控的该siRNA表达载体,观察其对肝癌细胞生长的影响。方法：根据siRNA设计原则,参照IGF-II mRNA序列设计3对siRNA序列及1对阴性对照序列,转染人肝癌Huh7细胞,转染24 h后采用实时荧光定量PCR检测IGF-II mRNA表达量变化,筛选干扰效率最高的siRNA序列。采用PCR扩增出hAFP及hTERT启动子的核心序列,应用基因重组技术构建重组hAFP和hTERT双启动子调控的该siRNA表达载体。将上述siRNA表达载体转染Huh7细胞及L-02人正常肝细胞,观察IGF-II mRNA表达及细胞生长情况变化。结果：实时荧光定量PCR显示,siRNA3在25 nmol/L浓度时抑制效率最高,约90%。成功扩增hAFP及hTERT启动子核心序列,将其分别克隆入pGL3-Basic载体,构建成重组pGL3-hAFP-hTERT载体;将siRNA3克隆至pGL3-hAFP-hTERT载体,构建成重组pGL3-hAFP-hTERT-siRNA3表达载体。Huh7细胞IGF-II mRNA表达量显著降低,抑制效率达86%,细胞增殖受到明显抑制,G1期细胞比例显著增加;L-02细胞上述指标无明显改变。结论: 成功构建双重RNA聚合酶II启动子（hAFP及hTERT双启动子）调控的针对IGF-II基因的siRNA表达载体,即pGL3-hAFP-hTERT-siRNA3;该siRNA表达载体可特异性抑制IGF-II mRNA表达及肝癌细胞生长。     

静态交锁髓内钉治疗26例股骨骨折

我院采用静态文锁髓内钉内固定治疗26例新鲜的股骨干骨折，骨折在伤后平均6．5天内采用Grosse－Kempf静态交锁髓内钉固定，骨折愈合平均时间是19周，无一例出现打的弯曲、断裂和骨折不愈合。交锁髓内针治疗股骨骨折是一种安全和有效的新技术。1临床资料1995年4月到1996年7月期间收治26例股骨干骨折，男20例，女6例，平均年龄324岁，均为外伤所致；26例均是闭合性骨折，其中13例是粉碎性，10例是斜形或螺旋形，3例是横断形。2手术方法我院采用Zimmer公司生产的Grosse－Kempf髓内针，患者取侧卧位，患肢在上，手术方法基本同一般股骨干骨折…     

选择性血管加压素V2受体拮抗剂治疗肝硬化腹水的Meta分析

目的 评价选择性血管加压素V2受体拮抗剂治疗肝硬化腹水的疗效及安全性.方法 检索PubMed、EMBASE、Web of Science、The Cochrane Central Register of Controlled Trials、中国期刊全文数据库、中国科技期刊数据库(维普)、万方数字化期刊全文数据库等关于选择性血管加压素V2受体拈抗剂治疗肝硬化腹水疗效及安全性的随机对照试验(RCT),使用RevMan5.0版软件对纳入的研究进行Meta分析.结果 共9项RCT包含1884例患者符合入选标准.Meta分析结果显示:①治疗组患者体重降低幅度明显大于安慰剂组(WMD=-1.98kg,95％CI:-3.24～-0.72kg,P=0.002);治疗组患者血清钠升高幅度明显大于安慰剂组(WMD=3.74mmol/L,95％CI:0.91～6.58mmol/L,P=0.01);治疗组患者腹水恶化的比例较安慰剂组明显降低(RR=0.51,95％CI:0.34～0.77,P=0.001).②治疗组患者尿量增加幅度明显大于安慰剂组(WMD=1437.65ml,95％CI:649.01～2226.30ml,P=0.0004);治疗组患者血肌酐与安慰剂组相比差异无统计学意义(WMD=-3.49μmol/L,95％CI:-12.54～5.56μmol/L,P=0.45).③治疗组患者心率、收缩压、舒张压和病死率与安慰剂组相比差异无统计学意义(P＞0.05);治疗组其他不良反应发生率(P=0.003)高于安慰剂组;治疗组死亡率与安慰剂组相比差异无统计学意义(P=0.49).结论 选择性血管加压素B2受体拮抗剂可以改善肝硬化腹水和稀释性低钠血症,并且对心脏和肾脏无明显影响,不良反应相对较少,可能成为肝硬化腹水治疗的一种新选择.     

RNA干扰与肝细胞癌治疗

RNA干扰(RNA interference,RNAi)是指利用双链RNA(double-strand RNA,dsRNA)诱导同源靶基因的mRNA特异性降解,导致转录后基因沉默的现象[1]。该技术已经成为基因功能、基因表达调控机制、新基因筛选、基因治疗和寻找     

脑脓肿8例临床分析

脑脓肿是一种常见的颅内化脓性疾病,它严重地危害人民的健康,手术死亡率较高。虽抗菌素已广泛应用于临床,神经外科的诊治水平亦不断提高,而脑脓肿的手术死亡率仍很高。由于临床上的症状常不典型,往往不能及时做出正确诊断,     

系统性红斑狼疮和干燥综合征重叠综合征1例

患者,女,31岁,因四肢关节酸痛伴口干1个月余,加重5 d于2011年10月5日入院.患者于1个月前无明显诱因下感四肢关节酸痛,以指间关节、腕关节、踝关节为主,伴双颊红斑,伴口干和口腔溃疡,伴眼睛干涩和异物感,大便干结,1次/d.于当地医院就诊,行自身抗体检测显示:抗核抗体、抗双链DNA抗体阳性,考虑诊断系统性红斑狼疮,给予泼尼松等治疗(具体剂量不详),服药7 d后颊部红斑消退,患者因症状缓解而自行停药.近5 d四肢关节酸痛及口干症状加重,遂来我院就诊.病程中,患者无晨僵、光过敏,无畏寒、发热,无便血.患者自发病以来,睡眠精神欠佳,胃纳差,小便正常,体重无明显改变.既往无高血压病、糖尿病、肝炎、结核病等病史.