HLA-A＊02／24限制的HBcAg表位特异性细胞毒T细胞克隆的建立及分析

目的建立HLA-A＊0201／2403限制的HBcAg表位特异性CTL细胞克隆。方法HLA-A＊0201／2403阳性HBV感染者的外周血单个核细胞（PBMC）分别用限制性表位肽HBc18-27和HBc117-125刺激,并以有限稀释法进行克隆化,期间单独使用植物血凝素（PHA）及联合使用表位肽刺激。用免疫荧光、流式细胞术以及乳酸脱氢酶释放实验对所获克隆进行鉴定。结果从HBc18-27活化的细胞中获得29株细胞克隆,其中28株为CD8^＋T克隆,均具有特异性细胞毒活性。从HBc117-125激活的细胞中获得12株CD8＋T克隆,其中9株有明显的细胞毒活性,另3株细胞毒活性则显著低下。克隆化过程中单独使用PHA及联合使用表位肽,克隆形成率分别为15.62％和14.58％。结论分别用表位肽HBc18-27和HBc117-125,能激活HLA-A＊0201／2403阳性HBV感染者的CD8^＋T细胞。建立CD8^＋T克隆过程中,表位肽的使用不能提高克隆形成率。     

CD8^＋T淋巴细胞非溶细胞功能抑制HepG2．2．15细胞表达HBV的实验研究

目的观察慢性乙肝患者病毒特异性CD8^＋T细胞体外非溶细胞功能抑制HepG2．2．15细胞表达乙型肝炎病毒的作用。方法选择低溶细胞活性的HBcAg肽特异性CD8^＋T细胞克隆（效应细胞）与HepG2．2．15细胞（靶细胞）以1：10共同培养,于24h、48h和72h收集培养上清,通过检测其中细胞因子及HBV产物的变化,观察CD8^＋T克隆对HBV的抑制作用。用抗体中和法观察CD8^＋T细胞分泌的细胞因子被封闭后HBV抑制的变化。结果HBV特异性CD8^＋T克隆与靶细胞共育后,培养上清可检出高水平IFN—γ和少量TNF-α.共育后对HBsAg、HBeAg和HBV-DNA的最高抑制率分别为71．2％、68．5％和78．3％,均在72h。IFN—γ和TNF—α单独和同时被抗体封闭后,对HBV—DNA的抑制率显著下降。对靶细胞的最大细胞毒活性是7．2％（24h）。结论IFN-γ和TNF-α是CD^＋T细胞非溶细胞机制清除病毒的主要效应分子。     

HLA-A·02/24限制的HBcAg表位特异性细胞毒T细胞克隆的建立及分析

目的建立HLA-A＊0201／2403限制的HBcAg表位特异性CTL细胞克隆。方法HLA-A＊0201／2403阳性HBV感染者的外周血单个核细胞（PBMC）分别用限制性表位肽HBc18-27和HBc117-125刺激,并以有限稀释法进行克隆化,期间单独使用植物血凝素（PHA）及联合使用表位肽刺激。用免疫荧光、流式细胞术以及乳酸脱氢酶释放实验对所获克隆进行鉴定。结果从HBc18-27活化的细胞中获得29株细胞克隆,其中28株为CD8^＋T克隆,均具有特异性细胞毒活性。从HBc117-125激活的细胞中获得12株CD8＋T克隆,其中9株有明显的细胞毒活性,另3株细胞毒活性则显著低下。克隆化过程中单独使用PHA及联合使用表位肽,克隆形成率分别为15.62％和14.58％。结论分别用表位肽HBc18-27和HBc117-125,能激活HLA-A＊0201／2403阳性HBV感染者的CD8^＋T细胞。建立CD8^＋T克隆过程中,表位肽的使用不能提高克隆形成率。     

CD8~+T淋巴细胞非溶细胞功能抑制HepG2.2.15细胞表达HBV的实验研究

目的 观察慢性乙肝患者病毒特异性CD8+T细胞体外非溶细胞功能抑制HepG2.2.15细胞表达乙型肝炎病毒的作用.方法 选择低溶细胞活性的HBcAg肽特异性CD8+T细胞克隆(效应细胞)与HepG2.2.15细胞(靶细胞)以1:10共同培养,于24 h、48 h和72 h收集培养上清,通过检测其中细胞因子及HBV产物的变化,观察CD8+T克隆对HBV的抑制作用.用抗体中和法观察CD8+T细胞分泌的细胞因子被封闭后HBV抑制的变化.结果 HBV特异性CD8+T克隆与靶细胞共育后,培养上清可检出高水平IFN-γ和少量TNF-α.共育后对HBsAg、HBeAg和HBV-DNA的最高抑制率分别为71.2%、68.5%和78.3%,均在72 h.IFN-γ和TNF-α单独和同时被抗体封闭后,对HBV-DNA的抑制率显著下降.对靶细胞的最大细胞毒活性是7.2%(24 h).结论 IFN-γ和TNF-α是CD8+T细胞非溶细胞机制清除病毒的主要效应分子.     

乙型肝炎病毒感染者血清和外周血单个核细胞培养上清细胞因子测定及临床意义

目的 观察不同HBV感染者血清和外周血单个核细胞(PBMC)培养上清中的细胞因子水平. 方法 采集不同HBV感染者血清;制备PBMC并用rHBcAg刺激,培养72h后收集培养上清.采用酶联免疫吸附法检测血清和培养上清中的IFN-γ和IL-4水平. 结果 血清IFN-γ水平,急性乙肝显著高于健康对照和HBV携带者(P<0.01和P<0.05),也高于慢性乙肝;慢性乙肝显著高于健康对照(P<0.05).血清IL-4水平,急、慢性乙肝均显著高于健康对照和HBV携带者(P<0.01和P<0.05),HBV携带者与健康对照相比差异无统计学意义.血清IFN-γ/IL-4比值,除慢性乙肝显著低于健康对照(P<0.01),其余组间差异无统计学意义.在PBMC培养上清中,急、慢性乙肝患者的IFN-γ水平显著高于健康对照和HBV携带者(P<0.05),急性肝炎组高于慢性组,但差异无统计学意义;HBV携带者与健康对照相比,差异无统计学意义.3个HBV感染组的IL-4水平与健康对照相比,差异无统计学意义. 结论 (1)与使用rHBcAg刺激后的PBMC培养上清相比,血清检测可能更加符合患者的真实细胞因子水平.(2)HBV感染时IFN-γ表达水平和IFN-γ/IL-4比值与疾病转归密切相关.