人脂肪干细胞向内皮分化最佳诱导体系的建立

目的 探讨人脂肪干细胞(human Adipose-derived stem cells,hADSCs)体外分化为内皮细胞的最佳诱导体系.方法 利用胶原酶消化法和贴壁筛选法从人脂肪组织中分离、培养及扩增hADSCs,分3组分别进行内皮诱导:即纤维连接蛋白(fibronectin,FN)包被组、明胶包被组和未铺组;同时诱导液分为两组:单纯内皮细胞生长培养基(EGM2-MV)组及内皮细胞生长培养基(EGM2-MV)+50 ng/ml血管内皮细胞生长因子(VEGF_(165))组.诱导15 d后,通过流式细胞术检测各组内皮细胞特异性表面抗原CD34的表达;通过相差显微镜观察诱导前后细胞的一般形态学特征.结果 体外分离、培养出高度同源性的hADSCs,CD29、CD44、CD90、CD105及CD166呈阳性表达,而CD34、CD45及HLA-DR呈阴性表达;诱导后细胞流式结果显示单纯EGM-2MV诱导的3组细胞内皮细胞特异性标志CD34阴性表达,而EGM2-MV+50 ng/ml VEGF_(165)诱导的细胞,其中FN包被组CD34表达率为8.4%,明胶包被组为5.4%,未铺组为4.2%;相差显微镜下可见诱导后细胞呈三角形或多边形,融合处呈铺路石样生长.结论 FN作为细胞外基质与EGM2-MV+50 ng/ml VEGF_(165)组成的诱导液协同作用,构成了hADSCs体外分化为内皮细胞的最佳诱导体系,可为临床上缺血性疾病的自体细胞移植治疗提供大量的种子细胞来源.     

术前细针穿刺洗脱液甲状腺球蛋白在诊断甲状腺乳头状癌淋巴结转移中的应用及影响因素

  目的  :探讨术前细针穿刺洗脱液甲状腺球蛋白(washout fluid thyroglobulin in fine-needle aspiration, FNA-Tg)在诊断甲状腺乳头状癌(papillary thyroid carcinoma, PTC)淋巴结转移中的应用及影响因素。  方法  :回顾性分析2015年9月至2016年12月浙江大学医学院附属邵逸夫医院131例经病理证实为PTC且术前进行可疑淋巴结FNA及FNA-Tg测定的患者资料, 以细针穿刺、手术病理或随访结果为"金标准", 绘制ROC曲线计算FNA-Tg最佳诊断阈值, 比较各检测方法(FNA、FNA-Tg和FNA+FNA-Tg)的诊断效能。进一步分析淋巴结解剖学分区、相关实验室指标对FNA-Tg诊断准确性的影响。  结果  :本研究中FNA-Tg的最佳诊断阈值为1.295 ng/mL。两者联合法诊断效能最佳, 灵敏度及特异度分别达96.4%和99.2%。FNA-Tg在诊断侧颈淋巴结转移准确性较好, 血清甲状腺球蛋白(serum Tg, sTg)是FNA-Tg>1.295 ng/mL的独立预测因子, OR值为1.018。  结论  :FNA-Tg是术前诊断PTC淋巴结转移, 尤其是侧颈淋巴结转移的重要方法。1.295 ng/mL可以成为最佳诊断阈值的参考值之一, 但sTg较高时, FNA-Tg的解读需要谨慎。      

转移潜能不同的人前列腺癌细胞系差异膜蛋白质组学的分析

目的：通过应用鸟枪法蛋白质组学技术发现早期诊断和逆转前列腺癌转移的分子标志。方法：应用鸟枪法蛋白质组学技术，比较人高转移前列腺癌细胞株（PC-3M）和人低转移前列腺癌细胞株（PC-3）间膜蛋白表达的差异。用sDSPAGE胶分离膜蛋白，并且进行胰酶消化，用反相液相色谱分离肽混合物后进行ESI-MS／MS鉴定，用数据库查询结合生物信息学技术比较分析并识别细胞间的差异表达膜蛋白。结果：1）利用Gel-1DLC-MS／MS分析，在严格的过滤参数条件下鉴定了PC-3和PC-3M两种细胞中的蛋白，在PC-3细胞中鉴定了2172个蛋白．在PC-3M细胞中鉴定了2023个蛋白。2）用GOA分析软件进行分类，PG3细胞中1499个蛋白为已知细胞组分，其中564（38．13％）个蛋白为膜蛋白或者膜相关蛋白；PC-3M细胞中1391个蛋白为已知细胞组分，细胞组分中527（38．30％）个为膜蛋白或者膜相关蛋白。几个假设蛋白和cDNA序列也被预测。3）用蛋白名称和IPI数据库号对比分析后发现有161个蛋白质仅在PC-3前列腺癌细胞株中检测到有表达，135个蛋白质仅在PC-3M中检测到有表达。结论：人高、低转移前列腺癌细胞株的膜蛋白表达存在明显差异，为进一步发现前列腺癌转移相关分子和阐明前列腺癌侵袭转移的分子机制提供实验证据。     

体外诱导人骨髓间充质干细胞定向分化为心肌细胞实验方法的建立

目的:探讨体外培养并诱导人骨髓间充质干细胞(hMSCs) 分化为心肌细胞（CMs）的实验方法。方法:采用密度梯度离心法联合贴壁培养法分离、纯化hMSCs,采用5-氮杂胞苷( 5-Aza)和碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)对hMSCs进行联合诱导,诱导3～4周,观察细胞形态学的变化,免疫组织化学方法鉴定肌细胞及心肌细胞特异蛋白的表达。结果:hMSCs体外经5-Aza 和bFGF联合诱导1～2周后,细胞体积较诱导前增大,呈长梭形。诱导2～3周后细胞伸出伪足呈多爪形;诱导3～4周后细胞伪足间相互连接形成肌管样结构。联合诱导3～4周后免疫组织化学鉴定结蛋白(Desmin)、肌钙蛋白(cTnⅠ)和横纹肌肌动蛋白（α-sarcomeric actin）表达均呈阳性。结论:hMSCs在体外经5-Aza和bFGF联合诱导可以分化为CMs。     

逆转录病毒介导的靶向人Slingshot-1L基因稳定转染人骨髓间充质干细胞系的建立

目的 建立过表达该基因的人骨髓间充质干细胞(hMSCs)稳定转染细胞系.方法 采用密度梯度离心法联合贴壁培养法分离、纯化hMSCs .应用脂质体法将Slingshot-1L 重组逆转录病毒载体pLNCX-Slingshot-1L转染PA317包装细胞,G418筛选,滴度测定.收集病毒上清感染第2代hMSCs,G418筛选,挑选阳性克隆,扩增培养.结果 采用密度梯度离心法联合贴壁培养法成功分离、纯化了hMSCs,应用pLNCX-Slingshot-1L重组逆转录病毒载体转染PA317包装细胞,获得滴度为5×10~8 CFU /L的病毒上清.收集病毒上清感染hMSCs,获得了过表达Slingshot-1L基因的hMSCs.结论 应用Slingshot-1L重组逆转录病毒载体,成功建立了过表达该基因的hMSCs稳定转染细胞系.     

逆转录病毒介导的靶向人Slingshot-1L基因的稳定转染细胞系的建立

目的 应用 Slingshot(SSH)-1L重组逆转录病毒载体,建立过表达该基因的稳定转染细胞系.方法 用脂质体法将含SSH-1L的重组逆转录病毒载体pLNCX-SSH-1L转染PA317包装细胞,G418筛选,滴度测定.收集病毒上清感染MG63细胞,G418筛选.结果 应用 pLNCX-Slingshot-1L重组逆转录病毒载体,获得滴度为5×10~8 CFU /L的病毒上清,感染MG63细胞,获得了过表达SSH-1L基因的MG63细胞.结论 应用SSH-1L重组逆转录病毒载体,成功建立了过表达该基因的稳定细胞系.     

转移潜能不同的人前列腺癌细胞系差异膜蛋白质组学的分析

目的:通过应用鸟枪法蛋白质组学技术发现早期诊断和逆转前列腺癌转移的分子标志.方法:应用鸟枪法蛋白质组学技术,比较人高转移前列腺癌细胞株(PC-3M) 和人低转移前列腺癌细胞株(PC-3) 间膜蛋白表达的差异.用SDS-PAGE 胶分离膜蛋白, 并且进行胰酶消化,用反相液相色谱分离肽混合物后进行ESI-MS/MS鉴定,用数据库查询结合生物信息学技术比较分析并识别细胞间的差异表达膜蛋白.结果:1)利用Gel-1DLC-MS/MS 分析,在严格的过滤参数条件下鉴定了PC-3和PC-3M两种细胞中的蛋白,在PC-3细胞中鉴定了2 172个蛋白,在PC-3M细胞中鉴定了2 023个蛋白.2)用GOA分析软件进行分类,PC-3细胞中1 499个蛋白为已知细胞组分,其中564 (38.13%) 个蛋白为膜蛋白或者膜相关蛋白;PC-3M 细胞中1 391个蛋白为已知细胞组分,细胞组分中527(38.30%)个为膜蛋白或者膜相关蛋白.几个假设蛋白和cDNA序列也被预测.3)用蛋白名称和IPI数据库号对比分析后发现有161个蛋白质仅在PC-3前列腺癌细胞株中检测到有表达,135个蛋白质仅在PC-3M中检测到有表达.结论:人高、低转移前列腺癌细胞株的膜蛋白表达存在明显差异,为进一步发现前列腺癌转移相关分子和阐明前列腺癌侵袭转移的分子机制提供实验证据.