长链非编码RNA ENSMUST00000127391对小鼠肾小球系膜细胞增殖和纤维化的影响

目的：探究长链非编码RNA ENSMUST00000127391（lncRNA 127391）在高糖培养的小鼠肾小球系膜细胞（mice mesangial cell,MMC）中的表达及功能。方法：在成功构建重组质粒pCDH?lncRNA 127391的基础上,将重组质粒pCDH?lncRNA 127391和对照质粒pCDH分别转染MMC细胞,通过RT?qPCR法检测lncRNA 127391表达水平。蛋白质免疫印迹法检测增殖和纤维化相关蛋白水平;CCK8法检测lncRNA 127391对MMC细胞增殖的影响;流式细胞术检测对细胞凋亡的影响。结果：过表达lncRNA 127391的MMC细胞构建成功。CCK8结果显示,lncRNA 127391表达增加后,MMC细胞增殖速度减慢;蛋白质免疫印迹结果表明过表达lncRNA 127391后,MMC细胞中细胞周期蛋白D1（Cyclin D1）、增殖细胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen,PCNA）、纤维连接蛋白（FN）和Ⅰ型胶原（Col?1）蛋白表达水平均下降;流式分析结果显示,过表达lncRNA127391后,MMC细胞凋亡数增加。两两比较,差异均有统计学意义（P < 0.05）。结论：lncRNA 127391可以抑制高糖培养的MMC细胞增殖和纤维化。     

FTO对小鼠肾小球系膜细胞m6A修饰及增殖能力的影响

目的：构建表达脂肪与肥胖相关（fat mass and obesity associated,FTO）基因的重组质粒,并检测其对小鼠肾小球系膜细胞（mice mesangial cell,MMC）N6?甲基腺嘌呤（m6A）修饰及增殖能力的影响。方法：PCR法扩增FTO基因片段,并将其插入表达载体 pCMV?MCS?EGFP质粒中以构建重组质粒pCMV?FTO。将目的质粒pCMV?FTO及对照质粒pCMV分别转染MMC,采用qRT?PCR法检测FTO mRNA表达水平,蛋白质印迹法检测细胞FTO蛋白和相关增殖标志物的表达,CCK8法检测细胞增殖,m6A RNA甲基化定量试剂盒检测m6A含量。结果：菌落PCR鉴定以及测序结果证实重组质粒pCMV?FTO构建成功。RT?qPCR及蛋白印迹结果显示转染目的质粒pCMV?FTO后FTO表达明显增加。过表达FTO后,m6A含量、细胞增殖水平及细胞周期蛋白D1（Cyclin D1）、增殖细胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen,PCNA）蛋白水平均显著下降。结论：FTO可以降低 MMC中m6A修饰水平及抑制细胞增殖。     

过表达羧肽酶E对高糖培养的小鼠肾小球系膜细胞增殖和凋亡的影响

目的：探究羧肽酶E（carboxypeptidase E,CPE）对高糖培养的小鼠肾小球系膜细胞（glomerular mesangial cell,GMC）增殖、周期及凋亡的影响。方法：PCR法扩增CPE基因片段,将其插入表达载体 pcDNA3.1质粒中以构建重组质粒pcDNA3.1?CPE。将质粒转染GMC细胞,通过蛋白质免疫印迹法检测CPE标签蛋白、增殖标志物细胞周期蛋白D1（CyclinD1）、增殖细胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen,PCNA）以及凋亡标记物Cleaved?caspase?3的表达;采用平板克隆、Cell Counting Kit?8（CCK?8）法以及流式分析法检测过表达CPE对高糖培养的GMC细胞增殖、细胞周期以及凋亡的影响。结果：成功构建CPE过表达的GMC细胞。平板克隆以及CCK?8实验表明,过表达CPE可以抑制GMC细胞的增殖能力。流式细胞学检测表明,与对照组相比,CPE过表达明显促进了细胞凋亡;细胞周期中G1期细胞明显增加,S期细胞明显减少,差异有统计学意义（P < 0.01）。结论：过表达CPE可以抑制高糖培养的小鼠GMC细胞增殖并诱导细胞凋亡。